[发明专利]一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法

摘要

一种应用于生物医学临床诊断领域中的包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：设计合成大肠杆菌噬菌体MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac site的上下游引物，以MS2噬菌体RNA作为模板，用上述引物进行RT-PCR扩增，最后将扩增产物连接到pMD18-T载体上进行测序，验证克隆的正确性；提取上述含有MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac site的pMD18-T质粒，使用NcoI和BamHI限制性内切酶将插入的成熟蛋白基因+包膜蛋白基因+Pac site片段分离下来，与经过NcoI和BamHI双酶切后的pET-28b载体进行连接，得到连接产物。该发明制备的含有HCV和HIV-1RNA片段的假病毒颗粒方法简单、容易操作、获得的假病毒克隆纯度高、是丙型肝炎病毒和艾滋病核酸诊断试剂盒的工作标准品和质控品的理想原料。

主权项

一种包含HCV和HIV核酸片段的人工双元假病毒颗粒的制备方法，其特征在于：该制备方法包括如下步骤：（一）MS2成熟蛋白基因和包膜蛋白基因的克隆（1）设计合成大肠杆菌噬菌体MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac site的上下游引物，上游引物序列为5'‑CCATGG TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAGC‑'3（SEQ No.1）；下游引物序列为5'‑GGATCC TGTCTTCGACATGGGTAATCC‑'3（SEQ No.2）；（2）以MS2噬菌体RNA作为模板，用上述引物进行RT‑PCR扩增，最后将扩增产物连接到pMD18‑T载体上进行测序，验证克隆的正确性；（二）假病毒表达载体pET‑28b/MS2的构建（1）提取上述含有MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac site的pMD18‑T质粒，然后使用NcoI和BamHI限制性内切酶将插入的成熟蛋白基因+包膜蛋白基因+Pac site片段分离下来，将其与经过NcoI和BamHI双酶切后的pET‑28b载体进行连接，得到连接产物；（2）将上述连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ，挑取阳性克隆进行培养，然后提取质粒用NcoI和BamHI进行双酶切鉴定，酶切结果能够分离出1700bp左右片段的，为正确的阳性克隆；（三）双元假病毒表达载体pET‑28b/MS2/HCV+HIV的构建（1）以HCV5'UTR和HIV‑15'LTR区域序列为制备假病毒的目标序列，其中HCV5'UTR序列长度为230bp，HIV‑15'LTR序列长度为250bp；（2）人工合成含有HCV和HIV‑I的基因片段，片段序列为：5'‑ATGGATCCCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATGCTGCATATAAGCAGCTGCTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAGCTAGGAAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTTAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGGGATCCAT‑'3（SEQ No.3），其中CAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTG为HCV5’UTR序列，其他为HIV‑15'LTR序列；（3）使用BamHI限制性内切酶将上述片段进行酶切，然后将其正向连接进入经过BamHI酶切后的pET‑28b/MS2载体中，得到连接产物；（4）将上述连接产物转化大肠杆菌BL21（DE3）中，挑取阳性克隆进行培养，然后提取质粒用BamHI和SacI进行双酶切鉴定，将正向连接的克隆作为正确的阳性克隆；（四）诱导表达和纯化将上述含有pET‑28b/MS2/HCV+HIV的阳性克隆接种在含卡那霉素的SOB液体培养基中振荡培养过夜，在培养基中添加IPTG来进行诱导表达；离心收集菌体，再进行超声碎菌处理，将细菌破碎物在进行14000r/min离心20min，取上清转移到另一干净离心管中；在上清中加入100U RNase A和50U DNase Ⅰ酶，37℃消化1h，将消化后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检验，核实上清液中的内源性DNA和RNA的是否消化彻底；将消化彻底的上清液贮存于‑20℃条件下，这些上清液就是制备的含有HCV和HIV‑1RNA的假病毒溶液。