[发明专利]绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的培养技术

摘要

本发明涉及一种绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的培养技术，具体包括以下步骤：(1)进行多核滋养层细胞原代培养；(2)进行多核滋养层细胞的传代培养；(3)针对上述制备细胞进行检测分析，包括：(3a)H·E染色：①胎盘子叶组织切片H·E染色；②滋养层细胞爬片H·E染色；(3b)免疫组织化学：①胎盘子叶免疫组织化学检测；②滋养层细胞爬片免疫组织化学检测；(3c)透射电镜法检测。本发明技术能够成功培养多核的绵羊绒毛膜滋养层细胞，细胞形态明显，大多是双核、多核细胞，且细胞核大而圆。该发明中的滋养层细胞能为类似关于该领域体外细胞的实验提供细胞基础，可以为推动妊娠滋养细胞疾病的诊断和治疗提供良好的实验基础。

主权项

一种绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的培养技术，其特征在于：具体包括以下步骤：(1)进行多核滋养层细胞原代培养，具体过程为：(1a)将新鲜的妊娠中期的绵羊胎盘用自来水冲洗一次，再用75％的酒精清洗3～5次，然后将其拿到经过消毒杀菌的操作间取材；(1b)使用高压过的手术器械，用手术剪将子宫壁剪开并将其打开，绵羊的胎盘属于子叶型胎盘且属于母包子型，绒毛膜滋养层所在部位为绒毛膜相嵌在肉阜内的部位，即为子叶；(1c)使用另一套手术器械，将子叶小心地放在已经配好的含有高浓度双抗(PS)的PBS中，反复洗2～3次；(1d)另外取5子叶用4％的多聚甲醛和2.5％的戊二醛固定，以备后面做石蜡切片和透射电镜标本；(1f)倾去PBS，用高压好的眼科剪将子叶快速的剪成糊状，准备培养细胞；(1g)用0.25％的胰蛋白酶37℃恒浴消化糊状组织30min，消化期间每隔5min振荡混匀一次，将上层不含组织的悬液转移至一个无菌的15ml离心管中；(1h)用胶原酶IV37℃恒浴消化组织30min，消化期间每隔5min振荡混匀一次；(li)两次消化下来的细胞经过100目细胞筛子过滤，滤液细胞1200rpm离心5min；(1j)弃去上清液，将细胞用含20％胎牛血清的DMEM完全培养基吹打起来，在涡旋振荡器上振荡混匀；(1k)将细胞接种在25cm2的培养瓶中，每瓶加3ml完全培养基，放入CO₂孵化箱中，控制条件温度37℃，CO₂浓度5.0％；(1l)每3d换一次完全培养液，当原代细胞贴壁为培养瓶壁的90％左右时，进行传代；(2)进行多核滋养层细胞的传代培养，具体步骤为：(2a)首次传代吸去瓶中的培养液，用PBS溶液洗培养瓶3次，弃去PBS；(2b)加入0.25％胰蛋白酶消化细胞，放在37℃培养箱中消化2min，轻轻敲细胞培养瓶，显微镜下观察贴壁细胞是否脱落；(2c)贴壁细胞是有90％以上脱壁时，用含血清的培养基终止消化1200rpm离心5min，弃上清；(2d)加入1ml完全培养基制成单细胞悬液，将细胞悬液按1∶2进行传代并做标记P1代，放入CO₂孵化箱中培养，控制条件温度37℃，CO₂浓度5.0％；(2e)待细胞再次长满培养瓶时进行二次传代，方法与首次传代一样，以此做法待细胞传代三次后，制作滋养层细胞爬片，以备鉴定；(3)针对上述制备细胞进行检测分析，具体为：(3a)H·E染色，具体为：①胎盘子叶组织切片H·E染色：将固定好的子叶经过自来水洗、梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，切片4μm，脱蜡、水化，HE染色；染色完成后中性树胶封片，显微观察并照相；②滋养层细胞爬片H·E染色：待传代2次的滋养层细胞长满经多聚赖氨酸处理过的盖玻片时，将玻片用PBS液洗3次，950mL/L的乙醇固定20min后，PBS洗2次，每次1min；苏木素染色15min，自来水洗2min，盐酸酒精分化4s，伊红染色1～2min；然后经脱水、透明后中性树胶封片，显微观察并照相；(3b)免疫组织化学，包括：①胎盘子叶免疫组织化学检测：石蜡切片经自来水洗、二甲苯脱蜡和梯度酒精水化到蒸馏水后，PBS洗2次，每次5min；滴加30mL/L的H₂O₂，消除其内源性过氧化物酶的活性；PBS洗2次，每次5min，进行抗原修复，在煮沸后的柠檬酸钠抗原修复液中高热微博修复15min，自然冷却至室温；PBS洗2次，每次5min，滴加适当比例(1∶300)稀释的一抗(CK7)，4℃孵育过夜；然后将切片放在37℃温箱内孵育1h，PBS洗2次，每次5min，滴加即用型MaxVisionTM试剂，室温下孵育20min；PBS洗2次，每次5min，滴加新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3～5min；最后核复染，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照；阴性对照试验用PBS代替一抗染色步骤同上；②滋养层细胞爬片免疫组织化学检测：取对数生长期的滋养层细胞，消化制成单细胞悬液，接种于预先放置有盖玻片的培养液中待细胞接近长成单层后，取出盖玻片PBS液漂洗3次，4％多聚甲醛固定15min；PBS液冲洗3次，每张滴加50μl3％H₂O₂，室温下孵育10min，以阻断其内源性过氧化物酶的活性；冲洗3次，除去PBS液，每张滴加50μl鼠抗羊CK7，4℃过夜；PBS液冲洗3次，除去PBS液，每张滴加50μl即用型MaxVisionTM试剂室温下孵育15min；PBS液冲洗3次，除去PBS液，每张滴加100μl新配制DAB溶液，显微镜下观察3‑5min；自来水冲洗，经过梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜下观察并拍照；阴性对照试验用代替一抗染色步骤同上；(3c)透射电镜法检测：将传代3次的长满细胞培养瓶壁的滋养层细胞用细胞刮子刮下来，用PBS液洗2次，把细胞收集到15ml离心管中，2000g/min，离心10min，将细胞离心成团；弃上清，用2.5％的戊二醛固定液预固定1h以上，将预固定的细胞2000g/min，离心10min；弃上清，用PBS液洗2次，离心2次，每次1600rpm离心5min；将配好的2％的琼脂水溶液保持在50～55℃之间，并将上述离心细胞温浴至50℃；用热吸管吸取热琼脂2ml到细胞团中，迅速吹打均匀，立即4000rpm，离心5min；待琼脂凝固后取出，放入2.5％的戊二醛固定液中静置，放入4℃冰箱中备用；将经过2.5％戊二醛固定液固定好的绵羊子叶组织块，修成适合制作电镜标本比例大小的组织块；然后用10mg/L四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，Epon812包埋，超薄切片光学定位并切片，醋酸铀及枸橼酸双重染色，透射电镜观察滋养层细胞超微结构并照相。