[发明专利]一种采用多次转化发酵法生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法

摘要

本发明涉及一种使用重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法，该方法包括平板活化培养、种子培养、发酵培养、由菌体提取脂肪与由发酵上清液提取脂肪等步骤。本发明采用二次补加葡萄糖的菌体培养模式，显著提高了重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9的生物量。同时，采用利用同一批菌体多次转化红花籽油的转化模式，大大提高了t10，c12-CLA产量。因此，本发明使用重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法具有非常好的工业化应用前景。

主权项

一种采用多次转化发酵法生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法，其特征在于该方法的步骤如下：A、平板活化培养使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM‑JU277‑9接种于装在平板中的固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度20～32℃的条件下平板活化培养2～6天，得到斜面培养物；B、种子培养使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种子培养基中，然后置于试管中，在温度20～32℃与150～250rpm的条件下培养40～52小时；C、发酵培养按照以发酵培养基体积计0.5%～2.0%接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度20～32℃与150～250rpm的条件下震荡培养使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM‑JU277‑9进入第一个生长稳定期，继续培养至葡萄糖浓度下降至0.1g/L；接着往该发酵培养基中第一次补加葡萄糖，使该发酵培养液中葡萄糖浓度达到10g/L～20g/L，继续培养使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM‑JU277‑9进入第二个生长稳定期，至葡萄糖达到0.1g/L；然后往该发酵培养基中第二次补加葡萄糖，使该发酵培养液达到10g/L～20g/L葡萄糖，继续培养使重组耶氏解脂酵母菌株CCFM‑JU277‑9进入第三个生长稳定期，添加终浓度为20‑70g/L的乳化红花籽油，继续培养35‑60小时，得到一种发酵培养物，它在7500～8500rpm的条件下离心分离10～18分钟，得到一次转化的菌体与发酵上清液；一次转化后的菌体用新鲜培养基重悬，然后添加终浓度为20‑70g/L的乳化红花籽油，置于发酵锥形瓶中在温度20～32℃与150～250rpm的条件下继续震荡培养35‑60小时，得到一种发酵培养物，它在7500～8500rpm的条件下离心分离10～18分钟，得到二次转化的菌体与发酵上清液；二次转化后的菌体再次用新鲜培养基重悬，然后添加终浓度为20‑70g/L的乳化红花籽油，并重复上述步骤，得到三次转化的菌体与发酵上清液；三次转化后的菌体再次用新鲜培养基重悬，然后添加终浓度为20‑70g/L的乳化红花籽油，并重复上述步骤，得到四次转化的菌体与发酵上清液；所述的多次转化后的菌体使用以重量计0.70～1.00%NaCl水溶液洗涤2～3次，得到的洗涤液与所述的第四次转化后的发酵上清液合并，合并的发酵上清液与前三次转化后的发酵上清液分别用于后续处理；洗涤的菌体接着进行冻干；D、由菌体提取脂肪按照以mg计冻干菌体与以ml计8～12%盐酸‑甲醇溶液之比为20～50：0.5～1.5，让步骤C所得到的冻干菌体与8～12%盐酸‑甲醇溶液在温度45～‑65℃的条件下进行甲酯化2.5～3.5小时，然后加入与盐酸‑甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着在5000～7000rpm的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的总脂肪酸甲酯；E、由发酵上清液提取脂肪按照以ml计发酵上清液与氯仿甲醇混合液之比为1:8.0～12.0，用按照体积比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并发酵上清液2～4次，提取液合并，用氮气吹干，再加入与氯仿甲醇混合液等体积的8～12%盐酸‑甲醇溶液在温度45～65℃的条件下进行甲酯化0.5～3小时，然后加入与盐酸‑甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着在3000～7000rpm的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的总脂肪酸甲酯。