[发明专利]一种使用含金属离子培养基生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法

摘要

本发明涉及一种使用重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法，该方法包括平板活化培养、种子培养、发酵培养、由菌体提取脂肪与由发酵上清液提取脂肪等步骤。本发明使用吐温-80乳化剂与二价锌离子，控制发酵培养基的初始pH值，采用变温培养模式，能够非常显著地提高了t10，c12-CLA产量，因此，本发明使用重组耶氏解脂酵母菌株CCFM-JU277-9生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法具有非常好的应用前景。

主权项

一种使用含金属离子培养基生产含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯的方法，其特征在于该方法的步骤如下：A、平板活化培养使用接菌环将重组耶氏解脂酵母菌株CCFM‑JU277‑9接种于装在平板中的固体培养基上，然后置于恒温培养箱中在温度20～32℃的条件下平板活化培养2～6天，得到平板培养物；B、种子培养使用接菌环挑取在步骤A平板活化培养的培养物接种到液体种子培养基中，然后置于试管中，在温度20～32℃与150～250rpm的条件下培养40～52小时；C、发酵培养按照以发酵培养基体积计0.5%～2.0%接种量，将步骤B得到的种子培养物转接到pH4.5～8.5的液体发酵培养基中，置于发酵锥形瓶中在温度20℃‑25℃与150～250rpm的条件下震荡培养35‑40小时，当重组耶氏解脂酵母菌株CCFM‑JU277‑9进入生长稳定期，再添加终浓度为30g/L的乳化红花籽油与10mM二价金属离子溶液，该乳化红花籽油含有以所述红花籽油重量计0.1～1.0%乳化剂，接着在温度28‑32℃与150～250rpm的条件下震荡培养48～100小时，得到一种发酵培养物，它在7500～8500rpm的条件下离心分离10～18分钟，得到菌体与发酵上清液；所述的菌体使用以重量计0.70～1.00%NaCl水溶液洗涤2～3次，得到的洗涤液与所述的发酵上清液合并，合并的发酵上清液用于后续处理；洗涤的菌体接着进行冻干；D、由菌体提取脂肪按照以mg计冻干菌体与以ml计8～12%盐酸‑甲醇溶液之比为 20～50：0.5～1.5，让步骤C所得到的冻干菌体与8～12%盐酸‑甲醇溶液在温度45～‑65℃的条件下进行甲酯化2.5～3.5小时，然后加入与盐酸‑甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着在5000～7000rpm的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯；E、由发酵上清液提取脂肪按照以ml计发酵上清液与氯仿甲醇混合液之比为1:8.0～12.0，用按照体积比1:1混合的氯仿甲醇混合液提取合并发酵上清液2～4次，提取液合并，用氮气吹干，再加入与氯仿甲醇混合液等体积的8～12%盐酸‑甲醇溶液在温度45～65℃的条件下进行甲酯化0.5～3小时，然后加入与盐酸‑甲醇溶液等体积的正己烷提取5～15分钟，接着在3000～7000rpm的条件下离心分离2～5分钟，在分离上清液后所得到的残余物再重复上述提取操作1～2次，分离上清液合并，用氮气吹干，得到所述的含有共轭亚油酸的脂肪酸甲酯。