[发明专利]一种人源产肠毒素大肠杆菌粘附素EtpA融合蛋白及其应用

摘要

本发明公开了一种人源肠毒素大肠杆菌粘附素EtpA融合蛋白及其应用，本发明提供了一种含有人源肠毒素大肠杆菌的粘附素基因的重组质粒pGEX‑etpA，将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)，诱导重组表达菌BL21(DE3)/pGEX‑etpA表达融合蛋白EtpA。利用表达的重组蛋白主动免疫初产蛋鸡，制备了针对这种蛋白的卵黄抗体，提取的卵黄抗体验证了重组蛋白具有良好的抗原性，并利用小鼠肠道攻毒试验及体外实验，证明提纯的卵黄抗体能够抑制ETEC菌株在小鼠肠道内及体外对上皮细胞的粘附。

主权项

一种人源产肠毒素大肠杆菌粘附素etpA融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括：在NCBI的GenBank中查找序列号为AY920525的基因座，其中etpA位于编码区2718‑8021，全长5304bp，目的片段是5'端的1701bp；以人源肠毒素大肠杆菌标准株H10407为试验材料，将PCR扩增后的目的片段连接至表达载体，得到重组质粒pGEX‑etpA；所述重组质粒pGEX‑etpA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述PCR扩增中所用引物为：引物名称引物序列酶切位点etpA‑FGGATCCATGAACCGTATATATAAACTGAAGBamhIetpA‑RCTCGAGCGACAGATTAACATTCAGXhoI其中，GGATCC为etpA‑F的酶切位点，CTCGAG为etpA‑R的酶切位点；将得到的重组质粒pGEX‑etpA转化入大肠杆菌BL21(DE3)，以诱导物异丙基‑β‑d‑硫代半乳糖苷做诱导表达；诱导表达条件为：37℃摇床培养至OD600达到0.5‑1.0，加入IPTG至0.1mM，继续培养3‑4h，最终表达量均在20％以上，以包涵体的形式存在；将包涵体经压力破碎、变性和复性浓缩后得到的包涵体蛋白etpA融合蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。