[发明专利]显著提高野生百合胚性愈伤组织继代增殖率的培养方法

摘要

本发明涉及植物快速繁殖技术领域，旨在提供显著提高野生百合愈伤组织继代增殖率的培养方法。该培养方法包括步骤：愈伤组织的诱导培养、愈伤组织的继代培养、愈伤组织的扩增培养。本发明以百合愈伤再生体系中的直径0.3～0.5cm的小团块的愈伤组织为对象，其突出的优势在于愈伤组织处理后在较短时间内获得非常高的增殖率，显著高于常规继代的愈伤组织增殖率，并且低温处理期间无需再进行继代，从而在节约人力时间的同时获得较高的增殖率，为以愈伤组织为基础的高效扩繁体系和遗传转化体系准备条件。

主权项

显著提高野生百合胚性愈伤组织继代增殖率的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）愈伤组织的诱导培养：在超净工作台上，取野生百合组培苗鳞片进行愈伤诱导培养，方法是将组培苗鳞茎的鳞片用镊子或解剖刀剥离，将其鳞片尖端切除0.3cm，并在其近轴面用解剖刀划1～3个创口，接种时以创口朝下接触愈伤诱导培养基表面，愈伤诱导培养20～50天后，获得直径0.3～0.5cm的浅黄色、颗粒状的胚性愈伤组织团块，愈伤诱导率为63.3%～79.1%；所述愈伤诱导培养是在完全黑暗、25℃的愈伤诱导培养条件下进行；用于接种的愈伤诱导培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，所述愈伤诱导培养基中还含有浓度为0.1～2.0mg/L的2,4‑二氯苯氧乙酸（2,4‑dichlorophenoxyacetic，2,4‑D)、0～1.0mg/Lα‑萘乙酸（1‑Naphthaleneacetic acid,NAA）、浓度为0.1～0.4mg/L的6‑苄氨基腺嘌呤（6‑benzyladenine,6‑BA）、30g/L的蔗糖、6～8g/L琼脂，愈伤诱导培养基的pH值为5.8；（2）愈伤组织的继代培养：愈伤诱导培养60～90天后，在超净工作台上用镊子或解剖刀剔除愈伤组织团块中褐色的老化部分，接种到新鲜的继代培养基上；每个装有继代培养基的培养皿中接种20～30块愈伤组织团块，愈伤组织团块的直径在0.3～0.5cm之间，每4周继代一次，每次继代可获得每月2～2.5倍的增殖率，即愈伤组织团块经过一个月的培养，重量增加为接种时的2～2.5倍；所述继代培养是在完全黑暗、25℃的继代培养条件下进行；用于接种的继代培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，所述继代培养基中还含有浓度为0.1～2.0mg/L的2,4‑D、0～1mg/Lα‑萘乙酸（1‑Naphthaleneacetic acid,NAA）、0.1～0.4mg/L的6‑苄氨基腺嘌呤（6‑benzyladenine,6‑BA）、30g/L的蔗糖、4～8g/L琼脂，继代培养基的pH值为5.8；（3）愈伤组织的扩增培养：愈伤组织团块在继代培养基上继代培养1～8个月后，将愈伤组织团块分切成0.5cm的小块，接种到含继代培养基的培养皿上，依次用经过紫外灭菌的保鲜膜和锡纸包裹，然后进行30～60天的低温处理，低温处理条件为1～4℃，完全黑暗；再将低温处理后的愈伤组织团块接种到扩增培养基上，进行弱光培养，弱光培养是指在光照100～900lux、温度25℃的条件下进行，且扩增培养基装在口径为6.35cm，高度为9.20cm的柱形瓶中；弱光培养60天后，将扩增后的愈伤组织团块分成0.3～0.5cm的小块，转接到新鲜的继代培养基上黑暗培养，黑暗培养是指：完全黑暗，温度25℃，继代培养基装在培养皿中；经过低温处理和弱光培养后的愈伤组织团块，即为增殖率15～36.6的愈伤组织；所述扩增培养基以MS培养基(Murashige and Skoog,1962)为基本培养基，即每升培养基添加4.43gMS粉，扩增培养基中还含有浓度为30g/L的蔗糖和4～8g/L琼脂，扩增培养基的pH值5.8。