[发明专利]一种从血浆中提取人凝血因子Ⅷ的工艺

摘要

本发明公开了一种提高凝血因子Ⅷ分离效率、活性、比活、回收率经济、简单的方法。此方法将冷沉淀先进行两次肝素钠洗涤，再通过一次离子交换层析，洗脱液洗脱最后得到较纯的凝血因子Ⅷ。和传统方法比较，本发明的优势在于操作简便，成本低，与此同时，还提高了分离效率、活性、比活和回收率。

主权项

一种从血浆中提取人凝血因子Ⅷ的工艺，其特征在于：包括以下步骤：① 将新鲜血浆进行一次沉淀：将新鲜冷冻血浆通过0～4℃水浴融化，并控制血浆温度在0～4℃，进行离心分离得到一次沉淀，离心时的进液速度≤2000mL/min，分离出液温度应不高于4.0℃；② 将步骤①得到的一次沉淀进行悬浮：将一次沉淀粉碎投入溶解液，水浴至26.0～29.0℃，搅拌溶解0.5小时，用浓度为0.25～0.3mol/L盐酸调pH为6.80～7.00，调整后加入2500IU/L的肝素钠溶液，速度200～400mL/分钟，使之终含量为60IU/L，向溶液中以500～600mL/min的速度加入溶液A（含31.56%聚乙二醇3350，0.32％枸橼酸钠，用1.0mol/L盐酸调pH为6.20～6.60，温度25.0±5.0℃）使制品中聚乙二醇浓度达到3.0％～5.0％，用0.5mol/L的醋酸溶液（加液速度控制在小于200mL/min）调整制品pH至6.50±0.20，降温至10.0～20.0℃后反应30分钟，静置1～2小时；③ 将步骤②得到的悬浮液进行离心分离出上清液：虹吸静置后的制品上清液进行离心分离，出液速度控制在1000～1500mL/min，温度控制在12.0～18.0℃，收集离心出液，离心出液应澄清，使用0.15～0.45mol盐酸调整制品pH至7.00±0.20，过滤离心后的上清，过滤制品压力不得高于0.3Mpa，速度不得高于5.0L/分钟，检查出液应澄清，滤液温度12.0～18.0℃；④ 将步骤③中的上清液进行病毒灭活：根据过滤后制品体积加入10%S/D溶液，至终溶液含S/D浓度为1.2%，终溶液含Triton X‑100为1.2%，含磷酸三丁酯0.4%；搅拌均匀后升温至23～25℃，连续搅拌3～5小时；⑤ 将步骤④灭活后的制品进行悬浮：灭活结束前使用平衡液（配方： 0.02mol/L三羟甲基氨基甲烷、3.5%的聚乙二醇3350，0.032%枸橼酸钠，pH为6.40～6.60），平衡装有澄清滤材的滤器及制品输送管道，将灭活后的制品澄清过滤入制作罐，滤液温度应在16～25℃；开启搅拌，搅拌转速控制在40～80转/分钟（频率为30%～50%），加入溶液III（配方：含31.56%聚乙二醇3350，0.32%枸橼酸钠， pH 5.60～5.80），添加速度在500～600mL/min，使制品中聚乙二醇浓度达到12.0±1.0％，加完后用0.5mol/L的醋酸溶液（加液速度控制在小于200mL/min），调整制品pH至5.80±0.10，再降温制品至7.0±2.0℃后搅拌反应30～60分钟，关闭搅拌静置60～90分钟；⑥ 将步骤⑤中的悬浮液进行离心分离出二次沉淀：离心分离蛋白沉淀，离心进出液速度控制在1000～2500mL/min，温度保持在6～9℃，收集沉淀，上清液废弃；⑦ 将步骤⑥离心分离出的二次沉淀物进行两次洗涤，两次离心分离出三次沉淀：用注射用水配制甘氨酸洗涤液（配制量为冷沉淀量的0.5～1倍体积），内含甘氨酸13.14%，枸橼酸钠7.53%， 肝素钠80.5μg/L，用1.0 mol/L 盐酸溶液调pH为6.65～6.75，降温至 ‑1.0～1.0℃备用，进行两次洗涤（加11～14倍沉淀量的洗涤液溶解沉淀，将沉淀切碎，切割搅拌速度控制在3000～4500rpm，台式离心机转速在3000～4000rpm，温度为0.0～4.5℃，分离时间为20分钟），得三次沉淀；⑧ 将步骤⑦中分离出的三次沉淀进行溶解分离：将三次沉淀加入溶解液（0.15mol/L NaCL），搅拌至完全溶解，并离心分离出上清液；⑨ 将步骤⑧得到的上清液进行一次层析纯化精制，得到用于制备人凝血因子Ⅷ制品的人凝血因子Ⅷ精制液：将溶解液上DEAE‑Fractogel TSK 650M柱，再经平衡液（0.11M NaCl）、洗涤液（0.15M NaCl）、洗脱液（0.25M NaCl）洗涤；⑩ 将步骤⑨得到的人凝血因子Ⅷ精制液透析、超滤、配液、分装。