[发明专利]一种基因C型鸭甲肝病毒的单克隆抗体及其应用

摘要

本发明以混合多肽与KLH载体蛋白通过半胱氨酸残基耦联作为抗原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓细胞进行融合，筛选得到杂交瘤细胞系5E3-9，微生物保藏号CCTCC NO:C2013135。用获得的杂交瘤细胞系制备的单克隆抗体特异性强，稳定性好，可在制备基因C型鸭病毒性肝炎抗体检测试剂方面得到广泛的应用。用获得抗体研制的ELISA试剂盒特异性强，稳定性好，可应用于基因C型鸭甲肝病毒抗体的检测。

主权项

一种基因C型鸭甲肝病毒单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）合成多肽TKNIEDETVK，KWSRNHRPFR，NLFESKLTPY，TTHQIETVTI，PEIPKYDGPI,SSFKQDVMDQ,MDQIQSPSTV，PVLEIQPWGV，GVARMRAYTA，每条多肽的C‑端加上半胱氨酸残基；（2）将上述多肽混合（优选以等重量混合）并与KLH载体蛋白通过半胱氨酸残基耦联作为抗原；（3）将制备好的抗原免疫6周龄BALB/c健康小鼠：抗原与弗氏完全佐剂1:1混合，腹腔注射；2周后加强免疫1次，抗原与弗氏不完全佐剂1:1混合，腹腔注射；之后每隔1周加强免疫一次，第4次增强免疫注射抗原，免疫后第3天，将小鼠脱颈椎处死，无菌取脾脏用于细胞融合；（4）杂交瘤细胞株的制备与筛选：按常规的细胞融合技术融合：取免疫小鼠的脾脏和SP2/0骨髓细胞进行融合，加入小鼠的胸腺细胞与融合细胞在HAT培养系中共培养；以步骤（1）合成的多肽作为包被抗原，用间接ELISA方法和系列稀释法进行筛选，经过3次克隆化，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100%，获得稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株为保藏编号为CCTCC NO.C2013135的杂交瘤细胞株；（5）取6～8周龄Balb/C小鼠，腹腔内注射无菌的液体石蜡0.5ml/只；1周后，腹腔内注射阳性杂交瘤细胞；接种杂交瘤细胞后7～10天，见小鼠腹部明显膨大，抽腹水，离心后收集上清，‑80℃冻存得到单克隆抗体的粗品；（6）粗品经纯化得到单克隆抗体，所述单克隆抗体为分子量为50KD左右为重链蛋白与分子量为25KD左右轻链蛋白的组合，为IgG2亚类。