[发明专利]基于S-层蛋白体外自组装的多功能生物纳米材料

摘要

本发明首次将炭疽芽孢杆菌S‑层蛋白EA1与甲基对硫磷水解酶MPH融合表达，通过体外自组装技术，获得了一种全新的基于S‑层蛋白体外自组装的多功能生物纳米材料。该材料制备步骤包括重组载体PQE30‑MPH和PQE30‑EA1‑MPH的构建，融合蛋白的表达与纯化，融合蛋白的体外自组装。本发明具备明显的生物学功能，能够延长MPH的贮存时间，在有机磷农药降解中充分、长期发挥作用，降低成本；具有抑菌、杀菌的应用前景；能够显著提高检测灵敏度，用于发展高灵敏检测元件。

主权项

一种多功能生物纳米材料，其特征是一种基于S‑层蛋白体外自组装的多功能生物纳米材料，该材料由包括以下步骤的方法获得：(1)重组载体PQE30‑MPH和PQE30‑EA1‑MPH的制备：扩增甲基对硫磷水解酶MPH基因，并克隆至商业化载体PQE30中，获得重组载体PQE30‑MPH；扩增炭疽芽孢杆菌S‑层蛋白EA1基因，并克隆至载体PQE30‑MPH中，获得重组载体PQE30‑EA1‑MPH；所述MPH基因的扩增引物是：5’‑ATATCTGCAGGCCGCACCGCAGGTG‑3’，5’‑GTGAAGCTTTTACTTGGGGTTGACGAC‑3’；所述EA1基因的扩增引物是：5’‑TGTAGGATCCGCAGGTAAATCATTC‑3’，5’‑GCCGAGCTCTAGATTTGGGTTATTA‑3’；(2)融合蛋白EA1‑MPH的制备：将重组载体PQE30‑EA1‑MPH通过常规CaCl₂转化法转化至大肠杆菌Escherichia coli M15中，表达、纯化融合蛋白：挑取单克隆于5ml双抗性LB培养基中，37℃过夜培养16～20h，按1％的接种量转接于双抗性LB培养基中，37℃培养至OD值为0.6～0.8，此时加入1mM的IPTG诱导目的蛋白质的表达，表达条件为28℃，4～5h；表达后的菌体6000rpm，4℃收集，超声破碎，用镍柱亲和纯化目的蛋白，并用BCA试剂盒测浓度；所述双抗性LB培养基由胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素组成；(3)体外组装多功能生物纳米材料：将30～100μg/ml上述融合蛋白EA1‑MPH置于pH 9.0的组装缓冲液中，该组装缓冲液为10mM CaCl₂﹑0.5mM Tris‑HCl，室温过夜组装；电镜观察，确定其形成具有规则晶格结构的纳米膜，该纳米膜为所述多功能生物纳米材料，具有P1对称晶格的膜状结构。