[发明专利]一种细胞杂交生产青蒿素的方法

摘要

本发明公开了一种细胞杂交生产青蒿素的方法，其特征在于它包括黄花蒿腺毛细胞的分离收集、黄花蒿腺毛细胞及植物中的模式细胞株BY2细胞的原生质体制备、原生质体的融合、融合杂交细胞的培养、建立杂交细胞系五个步骤。本发明采用酶法分离收集黄花蒿叶片的腺毛细胞，与植物中的模式细胞株BY2细胞开展原生质体融合后进行细胞培养，从中筛选出具有持续分裂增殖能力又能合成青蒿素的细胞，构建黄花蒿腺毛细胞与BY2细胞的杂交细胞系，进行细胞的大规模培养后分离得到青蒿素。本发明在实施过程中选择性高，显著提高青蒿素产率的同时大大提高了生产效率；生产条件温和易控制，具有良好的工业生产应用前景。

主权项

一种细胞杂交生产青蒿素的方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一、黄花蒿腺毛细胞的分离收集：取果胶酶1‑1.5g、半纤维素酶0.5‑1g溶于pH6.0磷酸缓冲液100ml中制成混合酶液，取黄花蒿无菌试管苗幼嫩叶片置于混合酶液中在30℃恒温条件下振荡处理25～40分钟；采用过滤装置过滤，收集滤液，通过离心收集黄花蒿腺毛细胞；步骤二、黄花蒿腺毛细胞及植物中的模式细胞株BY2细胞的原生质体制备：取纤维素酶1‑1.5g、半纤维素酶0.5‑1g、蔗糖3‑7g溶于pH6.0磷酸缓冲液100ml中制成混合酶液，将植物中的模式细胞株BY2细胞与步骤一中收集到的黄花蒿腺毛细胞分别悬浮在混合酶液中30℃条件下酶解0.5‑1小时；通过离心得到植物中的模式细胞株BY2细胞与黄花蒿腺毛细胞的原生质体；步骤三、原生质体的融合：将步骤二中得到的原生质体采用质量分数为5％蔗糖磷酸缓冲液冲洗3遍，黄花蒿腺毛细胞与BY2细胞体积比按照1∶1置于电融合杯中按原生质体融合模式进行电融合，通过显微镜检观察细胞融合效果；步骤四、融合杂交细胞的培养：融合细胞进行细胞培养，从中筛选出具有持续分裂增殖能力又能合成青蒿素的细胞，筛选出目标细胞；杂交细胞经分离培养形成不同的细胞株，对细胞株进行生长分析、青蒿素产生能力分析，对生长迅速、产青蒿素能力强的细胞株进一步筛选培养；步骤五、建立杂交细胞系：细胞株培养稳定后，建立起杂交细胞系，进行细胞的大规模培养后分离得到青蒿素。