[发明专利]单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的试剂盒及测定方法

摘要

单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的试剂盒及其测定方法，属于分子生物学检验领域。所述试剂盒包括：全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂和盒体。所述方法：人类全血基因组DNA提取；多重PCR扩增反应；单链DNA样本分离和纯化；焦磷酸测序与结果分析。用途：希望了解个体对乙醇和叶酸代谢能力情况的健康体检者；预测个体对硝酸甘油代谢能力和疗效，指导心梗患者合理选择和备用血管舒张急救药物；预测个体对叶酸的代谢能力，指导孕产妇和儿童补充适合剂量的叶酸补充剂等。

主权项

单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的试剂盒，其特征在于包括：（1）全血基因组DNA提取试剂：所述全血基因组DNA提取试剂来源于商品化的血液基因组提取试剂盒，主要成分有缓冲液GD、缓冲液GB、蛋白酶K、吸附柱CB3、漂洗液PW和洗脱缓冲液TB；（2）多重PCR扩增引物：所述多重PCR扩增引物包括：PCR引物1（Seq NO1）：ALDH2Glu504Lys（rs671）上游引物5’‑CAGTCACCCTTTGGTGGCTACA‑3’；PCR引物2（Seq NO2）：ALDH2Glu504Lys（rs671）下游引物5’‑CCAGCAGGTCCCACACTCAC‑3’；PCR引物3（Seq NO3）：MTHFR C677T（rs1801133）上游引物5’‑GGCTGACCTGAAGCACTTGAA‑3’；PCR引物4（Seq NO4）：MTHFR C677T（rs1801133）下游引物5’‑CAAGTGATGCCCATGTCGGT‑3’；其中引物1和引物3的5’端均进行生物素标记；（3）多重PCR扩增反应试剂：所述多重PCR扩增反应试剂名为“2X PyroMark PCR Master Mix”，具体成分包括热启动TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、镁离子Mg²⁺、钠离子Na⁺以及扩增反应特异性增强剂Q‑Solution；（4）单链DNA分离和纯化试剂：所述单链DNA分离和纯化试剂，包括链霉亲和素琼脂糖、PyroMark结合缓冲液、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液10X浓缩液；（5）焦磷酸测序引物：所述焦磷酸测序引物包括：测序引物1（Seq NO5）：ALDH2Glu504Lys（rs671）测序引物5’‑CACACTCACAGTTTTCACTT‑3’；测序引物2（Seq NO6）：MTHFR C677T（rs1801133）测序引物5’‑TGCGTGATGATGAAAT‑3’；（6）焦磷酸测序试剂：所述焦磷酸测序试剂为DNA焦磷酸测序的常规试剂，包括PyroMark退火缓冲液、酶复合物、底物复合物和脱氧核糖核苷三磷酸复合物dNTP，其中dATP为人工修饰的α‑硫代脱氧腺苷三磷酸，其余脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸未修饰；所述酶复合物包括焦磷酸测序所有需要的酶，即DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶；所述底物复合物为腺苷‑5’‑磷酸硫酸酐；（7）盒体：全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂设在盒体内。