[发明专利]用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒及其检测方法

摘要

用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒及其检测方法，涉及华法林。所述试剂盒包括：全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂和盒体。所述检测方法：人类全血基因组DNA提取；多重PCR扩增反应；单链DNA样本分离和纯化；焦磷酸测序与结果分析。通过检测影响华法林个体剂量差异的最主要因素，即VKORC1和CYP2C9的重要基因多态性位点，具体为VKORC1-1639G>A、CYP2C9*2和CYP2C9*3，达到指导需要服用华法林者使用个体化剂量进行治疗，以降低副作用的目的。

主权项

用于指导华法林个体化用药的多重PCR联合焦磷酸测序试剂盒，其特征在于包括：（1）全血基因组DNA提取试剂：所述全血基因组DNA提取试剂来源于商品化的血液基因组提取试剂盒，成分有缓冲液GD、缓冲液GB、蛋白酶K、吸附柱CB3、漂洗液PW和洗脱缓冲液TB；（2）多重PCR扩增引物：所述多重PCR扩增引物包括：PCR引物1（Seq NO1）：VKORC1‑1639G>A（rs9923231）上游引物5’‑GGGAAGTCAAGCAAGAGAAGACCT‑3’；PCR引物2（Seq NO2）：VKORC1‑1639G>A（rs9923231）下游引物5’‑GCCTCCAGGGTTCAAGTGG‑3’；PCR引物3（Seq NO3）：CYP2C9*2（rs1799853）上游引物5’‑TACAGAGCTCCTCGGGCAGA‑3’；PCR引物4（Seq NO4）：CYP2C9*2（rs1799853）下游引物5’‑CAGCGGGCTTCCTCTTGA‑3’；PCR引物5（Seq NO5）：CYP2C9*3（rs1057910）上游引物5’‑TAAAGTCCAGGAAGAGATTGAACG‑3’；PCR引物6（Seq NO6）：CYP2C9*3（rs1057910）下游引物5’‑GGGGACTTCGAAAACATGG‑3’；其中引物2、引物4、引物5的5’端均进行生物素标记；（3）多重PCR扩增反应试剂：所述多重PCR扩增反应试剂名为“2X PyroMark PCR Master Mix”，PyroMark PCR Kit试剂盒，成分包括热启动Taq DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、镁离子Mg²⁺、钠离子Na⁺以及扩增反应特异性增强剂Q‑Solution；（4）单链DNA分离和纯化试剂：所述单链DNA分离和纯化试剂包括链霉亲和素琼脂糖、PyroMark结合缓冲液、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液10X浓缩液；（5）焦磷酸测序引物：所述焦磷酸测序引物包括：测序引物1（Seq NO7）：VKORC1‑1639G>A（rs9923231）测序引物5’‑CCTGAAAAACAACCATTG‑3’；测序引物2（Seq NO8）：CYP2C9*2（rs1799853）测序引物5’‑GAGGAGCATTGAGGAC‑3’；测序引物3（Seq NO9）：CYP2C9*3（rs1057910）测序引物5’‑TGGGGAGAAGGTCAA‑3’；（6）焦磷酸测序试剂：所述焦磷酸测序试剂为DNA焦磷酸测序的常规试剂，包括PyroMark退火缓冲液、酶复合物、底物复合物和脱氧核糖核苷三磷酸复合物dNTP，其中dATP为人工修饰的α‑硫代脱氧腺苷三磷酸，其余脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸未修饰；所述酶复合物为焦磷酸测序所有需要的酶，包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶；底物复合物为腺苷‑5’‑磷酸硫酸酐；（7）盒体：全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂设在盒体内。