[发明专利]人脂肪间充质干细胞的制备方法

摘要

本发明公开了一种人脂肪间充质干细胞的制备方法，具体包括脂肪的采集、运输、交接、制备脂肪微块、脂肪微块冻存和复苏、SVF提取、原代和传代培养，工艺简便，成本低，冻存效果好，细胞损伤小，最大程度降低了冻存液在细胞内残留，副作用小，对人体无害，制备出的人脂肪间充质干细胞可以用于临床治疗多种疾病。

主权项

一种人脂肪间充质干细胞的制备方法，其特征在于：它包括以下具体步骤：（1）、脂肪的采集：无人源特定病毒的供体筛选合格后，无菌采集脂肪，可采用抽脂方式或者手术方式获取脂肪，采集量 10ml以上，采集后，将脂肪置于保存液中，2‑8℃恒温保存；（2）、脂肪的运输：将脂肪置于保存液中，2‑8℃恒温保存在疫苗箱中，48h内送至实验室；（3）、脂肪的交接：实验室接收脂肪，登记好客户信息，并进行客户编码；（4）、制备脂肪微块：用含青霉素和链霉素的PBS反复冲洗，去除残留的血液，将脂肪绞碎为0.5‑1mm³的脂肪微块；（5）、脂肪微块的冻存：二甲基亚砜和血清替代品按照1:9的比例混合配成冻存液，将脂肪微块用冻存液重悬，分装到冻存管中，放入冻存盒，置于‑80℃冰箱过夜后，次日转移到液氮保存；（6）、脂肪微块的复苏：从液氮中取出要复苏的脂肪组织微块，立即投入37℃无菌水浴锅中，匀速轻轻摇晃，使其在2分钟之内融化；（7）SVF提取：0.1%胶原酶I消化脂肪微块，离心弃去上层，100um滤网过滤，获得SVF；（8）、原代培养：按照1×10⁵个／ml接种到培养瓶，将培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱，培养条件： 37±0.5℃，二氧化碳体积分数为5±0.2% ，培养：人间充质干细胞无血清培养基；（9）、传代培养：原代培养经7d左右，细胞融合达70%～80%时，按照5000～6000个/cm²的密度传P1，经3d，P1代融合达80%～90%时，同上，传P2，以此类推。