[发明专利]Orexin多肽的化学制备方法及用途

摘要

本发明公开了一种orexin多肽的化学规模化合成方法，其包括下述步骤：（1）采用Rink Amide Resin法合成线性粗肽制备树脂。（2）进入AA循环，将步骤（1）所得的反应产物，采用固相合成法，按序逐一合成，得到33个氨基酸的线性粗肽。（3）将步骤2所得的线性粗肽，先用双氧水氧化形成6和12位间的第一对二硫键，然后利用碘剂直接形成7和14位间的第二对二硫键，得环化的orexin粗肽溶液。（4）将步骤3所得的环化的orexin粗肽溶液经分离性HPLC纯化、转盐及冷冻干燥后，得到orexin多肽。（5）利用Kaiser检测法和HPLC‑MS法，完成步骤4所得orexin多肽的结构和纯度测定。由于orexin多肽是正常存在于人体中的一种神经多肽，因此就开发成药品的角度而言，其具有毒副作用小，对正常生理功能干扰小等独特优势。

主权项

一种orexin多肽化学合成方法，其特征在于包括以下步骤：（1）称取10mmol树脂替代度为0.3~0.45mmol/g的Rink Amide Resin的原料倒入反应柱，加入300±20mL的DCM溶涨10min；待溶涨结束后，抽掉DCM液，加200±20mL的20%哌啶/DMF溶液脱保护两次，两次脱保护之间用200±20mLDMF洗涤一次，每次1min，抽调；脱保护完成后，用茚三酮检测显阳性，进入下一步反应；（2）称取17.67±0.1g 的Fmoc‑Leu‑OH以及8.106±0.1g的HOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴5min，然后再加入9.287±1mL DIC于溶液中活化5min后，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（1）得到的树脂被均匀吹起，反应温度为25‑30℃，反应时间1‑2h；反应完成后，取样茚三酮检测，显阴性，表明偶联反应完全，加入200±20 mL的DMF洗涤；（3）称取19.875g±0.1g Fmoc‑Thr(tBu)‑OH和8.106±0.1g HOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC于溶液中活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（2）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（4）称取17.670±0.1g Fmoc‑Leu‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC于溶液中活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（3）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（5）称取17.670±0.1g Fmoc‑Ile‑OH和8.106±0.1g HOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（4）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（6）称取14.865±0.1g Fmoc‑Gly‑OH 和8.106±0.1g HOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（5）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（7）称取16.45±0.1g Fmoc‑Ala‑OH和8.106±0.1g HOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（6）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（8）称取16.45±0.1g Fmoc‑Ala‑OH和8.106±0.1g HOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（7）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（9）称取30.985±0.1g Fmoc‑ His(Trt)‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（8）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（10）称取29.835±0.1g Fmoc‑Asn(Trt)‑OH和8.106±0.1 g HOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（9）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（11）称取14.865±0.1g Fmoc‑Gly‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（10）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（12）称取16.45±0.1g Fmoc‑Ala‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（11）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（13）称取14.865±0.1g Fmoc‑Gly‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（12）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（14）称取30.985±0.1g Fmoc‑His(Trt)‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（13）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（15）称取17.67±0.1g Fmoc‑Leu‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（14）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（16）称取29.835±0.1g Fmoc‑Leu‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（15）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（17）称取21.274±0.1g Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（16）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（18）称取22.975±0.1g Fmoc‑Tyr(tBu)‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（17）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（19）称取17.67±0.1g Fmoc‑Leu‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（18）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（20）称取32.439±0.1g Fmoc‑Arg(pbf)‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（19）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（21）称取29.285±0.1g Fmoc‑Cys(Trt)‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（20）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（22）称取19.17±0.1g Fmoc‑Ser(tBu)‑OH和8.106±0.1g HOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（21）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（23）称取20.70±0.1g Fmoc‑Cys(Acm)‑OH和8.106±0.1g HOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（22）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（24）称取19.875±0.1g Fmoc‑Thr(tBu)‑OH和8.106±0.1g HOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（23）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（25）称取23.425±0.1g Fmoc‑Lys(Boc)‑OH和8.106±0.1g HOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（24）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（26）称取30.535±0.1g Fmoc‑Gln(Trt)‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（25）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（27）称取32.439±0.1g Fmoc‑Arg(pbf)‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（26）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（28）称取29.285±0.1g Fmoc‑Cys(Trt)‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（27）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（29）称取29.835±0.1g Fmoc‑Cys(Acm)‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（28）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（30）称取20.573±0.1g Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（29）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（31）称取16.87±0.1g Fmoc‑Pro‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（30）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（32）称取17.670±0.1g Fmoc‑Leu‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（31）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（33）称取16.87±0.1g Fmoc‑Pro‑OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（32）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（34）称取6.125±0.1g pGlu和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（33）得到的树脂被均匀吹起，25‑30℃反应，时间：2‑3h；反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步；（35）配置900ml裂解液置烧杯中冷冻30min，裂解试剂配比：TFA:苯甲硫醚:EDT:苯甲醚=90：5：3：2；将步骤（34）所得产物74.0g的肽树脂缓缓加入到冷冻的裂解液中，室温裂解3h，过滤，将含多肽的裂解液缓缓加入到3.1L的冰乙醚中，静置30min后离心，室温放置10min，得固体产物则进入下一步；（36）第一对二硫键的环化：将步骤（35）所得的产物研磨成粉末状，加入5.6L乙腈超声至浊状再加入 22.4L的纯化水超声至溶解，溶解浓度1mg/ml；用碳酸氢钠调溶液pH至7.2，再加入稀释10倍的0.6ml的双氧水进行搅拌环化，分别于20、30min取样采用HPLC观察是否有环肽生成，直至环化完成后浓缩，冻干，称重；（37）第二对二硫键的环化：将第一对二硫键环化成功的产物称重、溶解于10%的醋酸中得到5‑10mg/ 1ml溶液,并称取产物摩尔量的20‑30倍的碘剂并将其溶解于甲醇中，将碘溶液慢慢加入溶有粗品的10%醋酸溶液至溶液淡黄色，反应3‑4h，采用HPLC观察是否有环肽生成，最后加入抗坏血酸水溶液至溶液变成透明状则进入下一步；（38）将步骤（37）所得产物纯化，冷冻干燥，即得orexin多肽。