[发明专利]一种多基因组合表达制备藻类红色素的方法及应用

摘要

本发明公开了一种多基因组合表达制备藻类红色素的方法，具体地说是一种利用多基因组合表达技术生产可应用在制备免疫荧光分析或功能食品中的藻类红色素的制备方法及其应用。具体步骤包括：由螺旋藻中克隆出藻类红色素合成关键酶基因（hox1和pebS），通过多基因组合表达技术，将两个关键酶基因导入受体细胞中，从而在受体细胞中建立藻类红色素的生物合成途径。经该两步酶促催化反应，可以利用大肠杆菌体内的血红素转化合成藻类红色素。最后经萃取、制备HPLC等纯化步骤，得纯度在95%以上的高纯度藻类红色素。本发明所得藻类红色素最大吸收波长为550nm，最大荧光发射波长为570nm。此法制备的藻类红色素藻类红色素可以作为荧光探针或色素类抗氧化剂应用于制备功能食品的有效成份中。

主权项

 一种多基因组合表达制备藻类红色素的方法，分别由集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803和Prochlorococcus phage P‑SSM2中克隆出藻类红色素合成关键酶基因（血红素氧化酶基因hox1和藻类红色素藻类红色素合成酶基因pebS），采用多基因组合表达方法，将该两基因导入大肠杆菌中，以大肠杆菌自身血红素为底物，通过Hox1和PebS两步酶促催化反应，在受体细胞中建立重组藻类红色素的生物合成途径，从而获得相应的大肠杆菌重组工程菌株，并应用此工程菌株生产重组藻类红色素，其制备步骤：（1）根据Genebank中公布的集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803血红素氧化酶基因hox1和Prochlorococcus phage P‑SSM2藻红素合成酶基因pebS的基因序列，设计适当引物，分别以集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803和Prochlorococcus phage P‑SSM2基因组DNA为模板，采用基因工程方法，克隆藻类红色素合成关键酶基因hox1和pebS；（2）采用多基因组合表达方法将上述步骤（1）克隆得到的藻类红色素合成关键酶基因hox1和pebS重组到适当表达载体上，并将此构建重组表达载体转入大肠杆菌中，得到大肠杆茵工程茵株；（3）将上述步骤（2）所得到的大肠杆菌工程菌株在37℃培养至OD₆₀₀＝0.5~0.7菌体浓度后，降温至25℃，利用IPTG作为诱导剂进行诱导，继续避光培养24小时，离心收集菌体；（4）将上述步骤（3）收集到的菌体用甲醇悬浮萃取2小时，离心分离后，上清液即得藻类红色素粗提液，将藻类红色素粗提液与等体积的氯仿混合，萃取出多余的蛋白质，然后再经制备型HPLC进一步精制，得到高纯度的藻类红色素，将藻类红色素溶液冷冻干燥或旋转蒸发除去多余水分，即得高纯度藻类红色素粉末产品。