[发明专利]基于免疫沉淀法的从水稻中提取多聚核糖体的方法

摘要

本发明属于分子生物学技术领域，具体为一种基于免疫沉淀法的从水稻中提取多聚核糖体的方法。本发明以免疫法为主，使用亲和层析的方法富集Flag标签标记的核糖体-mRNA复合物，选用EGTA螯合组织匀浆液中的其它金属离子，并加入氯霉素和放线菌酮抑制核糖体和mRNA的解离，其中改进抽提溶液和洗脱溶液配方、材料匀浆和浓缩方式，使用终浓度为0.1M的EDTA洗脱核糖体-mRNA复合物。本发明预期将分离2-4个重要的参与低温胁迫的新功能基因，为低温胁迫下的植物生长正常进行以及繁衍提供保障，最终在产量建成上发挥重要作用。

主权项

 一种基于免疫沉淀法的从水稻中提取多聚核糖体的方法，其特征在于具体步骤为：（1）首先，构建融合Flag标签的核糖体蛋白RPL18的过表达水稻植株，在此转基因植物体内得到Flag标签标记的核糖体‑mRNA复合物；其中，所述的融合Flag标签的核糖体蛋白RPL18在水稻中有6个基因编码，其中3个属RPL18A，另外3个属RPL18B，选取OsRPL18B1(Os03g0341100)、OsRPL18B2(Os05g0155100)两个基因添加标签；所述的过表达植株通过构建融合Flag标签的OsRPL18B1(Os03g0341100)、OsRPL18B2(Os05g0155100)植物表达载体，分别转入水稻日本晴中，以使融合蛋白在35S启动子及Ω‑HF增强子的启动下实现过表达；（2）其次，使用亲和层析方法，将此Flag标签标记的核糖体‑mRNA复合物富集起来，具体是选用EGTA螯合组织匀浆液中的其它金属离子，并加入氯霉素和放线菌酮抑制核糖体和mRNA的解离；其中，改进抽提溶液和洗脱溶液配方、材料匀浆和浓缩方式，使用终浓度为0.1M的EDTA洗脱核糖体‑mRNA复合物；具体步骤为：首先，进行植物组织的破碎，所用的材料匀浆要求加入材料二倍体积的PEB于液氮研磨的材料粉末之中，并在液氮中共研；所述的EGTA螯合剂保持溶液中高浓度的镁离子状态，配制母液0.5M EGTA，用NaOH调至pH8.0；所述的氯霉素和放线菌酮能够有效抑制核糖体和mRNA的解离，配制母液50mg/mL 放线菌酮，乙醇溶解；50mg/mL 氯霉素，乙醇溶解；其次，用亲和层析的方法富集多聚核糖体，使用超滤的方法将抽提溶液逐步置换为Wash溶液；同时，超滤也去除一部分低分子量的成分，减少了杂质；在抽提溶液体系中，加入终浓度为20U/ml的RNAsin；所述的Wash溶液也是体系与Flag beads结合时的溶液，配方中除去DTT成分，仅靠PMSF来防止蛋白质降解；最后，将富集的多聚核糖体上的mRNA洗脱下来，在高浓度EDTA的存在下，由于镁离子被结合，核糖体‑RNA复合物会发生解离；洗脱用的洗脱液为终浓度0.1M EDTA，配制母液0.5M EDTA，用NaOH调至pH8.0。