[发明专利]一种坦布苏病毒双抗体夹心ELISA检测方法

摘要

本发明提供了一种坦布苏病毒双抗体夹心ELISA检测方法；本发明包括单克隆抗体制备、酶标抗体的选择和ELISA检测程序等步骤；本发明建立的坦布苏病毒夹心ELISA检测方法具有快速、稳定、特异性高、灵敏度高，使用本发明只需使用棉拭子采集气管或泄殖腔分泌物或其它含有坦布苏病毒的样品，即可快速检测样品中是否含有坦布苏病毒；本发明适合应用于鸭场对鸭群是否感染坦布苏病毒的大批量检测。本发明首次用血清学方法进行坦布苏病毒的检测。与现有技术相比，本发明更适合于基层进行大规模的病原检测，是一种简便，快速，特异的双抗体夹心ELISA方法。

主权项

一种非疾病诊断目的的坦布苏病毒双抗体夹心ELISA检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)单克隆抗体制备 使用坦布苏病毒作为抗原免疫6周龄雌性BALB/c小鼠，待抗体效价达到104以上三天后，将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞采用PEG法进行细胞融合，间接ELISA法检测抗体并筛选阳性杂交瘤细胞，杂交瘤细胞制备的腹水单克隆抗体用辛酸‑硫酸铵方法纯化，用1×pH9.6碳酸盐缓冲液将单抗溶液稀释为2μg/mL；2)酶标抗体的选择利用高碘酸钠法对步骤1)中稀释为2μg/mL的单抗溶液进行HRP标记，并利用ELISA法对HRP标记的单抗溶液进行活性鉴定；鉴定步骤：将步骤1)中稀释为2μg/mL的单抗溶液包被96孔ELISA板，以坦布苏病毒为抗原，以HRP标记的单抗溶液为标记抗体，进行ELISA试验，测定各孔反应液OD450nm值；以OD450nm值最高的为酶标抗体；3)ELISA检测程序e1包被 将步骤1)中浓度为2μg/mL的单抗溶液按照100μL/孔包被96孔酶标板，4℃过夜；e2洗板 包被的酶标板按照200μL/孔加入PBST稀释液，震荡洗涤5min，重复四次，甩干；e3封闭 步骤e2甩干的酶标板按照200μL/孔加入PBST封闭液封闭，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复四次，甩干；e4加样 将待检样品按照100μL/孔加入封闭后甩干的酶标板，置于37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复四次，甩干；e5添加酶标抗体 将步骤2)中选择的酶标抗体用PBST稀释液按照体积比1:1000稀释后，按照100μL/孔加入酶标板，37℃孵育1h，震荡洗涤5min，重复四次，甩干；e6 TMB显色 加入TMB显色液，每孔100μL，37℃避光显色15min；e7终止 每孔加入50μL 3M H2SO4终止液终止显色反应，在酶标仪上读取各孔反应液OD450nm的值；f、阴阳性临界值的确定根据公式：阴阳性临界值＝阴性样本OD450nm平均值+3SD，得到阴阳性临界值,其中SD为标准偏差,当OD450nm在0.2以上，判断为阳性，即待检样品中含有坦布苏病毒。