[发明专利]一种紫菜蛋白抑菌肽的制备方法有效

专利信息
申请号: 201410131251.3 申请日: 2014-04-03
公开(公告)号: CN103865973A 公开(公告)日: 2014-06-18
发明(设计)人: 田亚平;刘冬冬;周锋 申请(专利权)人: 江南大学
主分类号: C12P21/06 分类号: C12P21/06;C07K1/30;C07K1/18;C07K1/16
代理公司: 无锡市大为专利商标事务所(普通合伙) 32104 代理人: 时旭丹;刘品超
地址: 214122 江苏省无锡市滨*** 国省代码: 江苏;32
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摘要: 一种紫菜蛋白抑菌肽的制备方法,属于天然活性物质提取领域。本发明以条斑紫菜为原料,经过烘干、粉碎等预处理后,将原料经过超声波破碎以及硫酸铵沉淀蛋白后,利用木瓜蛋白酶特定条件下酶解紫菜原料得到抑菌肽的粗品,该粗品经过离子交换层析、G-25凝胶层析等色谱方法分离纯化,得到紫菜蛋白抑菌肽。该紫菜蛋白抑菌肽分子量主要分布在1000Da以下,最适作用pH为6.5,热稳定性好;对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都有效果,其中对革兰氏阳性菌抑制效果更强,其抑菌效果主要是通过对细胞膜的破坏作用达到的。该紫菜蛋白抑菌肽分子量小,抑菌活性较好,在制备抗菌性药物、食品保鲜剂等领域具有很好的应用前景。
搜索关键词: 一种 紫菜 蛋白 抑菌肽 制备 方法
【主权项】:
一种紫菜蛋白抑菌肽的制备方法,其特征在于步骤为:(1)紫菜蛋白的提取和酶解:a、以条斑紫菜为原料,烘干后粉碎,过筛,取60‑80目部分溶于0.02mol/L、pH 7.0的Na2HPO4‑KH2PO4缓冲液中,溶解时紫菜与缓冲液料液质量体积比为1:25;在冰浴条件下用350 W功率的超声波处理15 min,处理时以工作3 s,间隔3 s为一个循环;将超声处理后的物料以4000 r/min的速度离心15 min,去沉淀,取上清液,添加硫酸铵至60%饱和度,通过盐析提取,离心收集固体物紫菜蛋白;b、将步骤a中硫酸铵盐析得到的紫菜蛋白按湿重计,以紫菜蛋白与缓冲液料液质量体积比为1:10加入pH6.5的Na2HPO4‑KH2PO4缓冲液,木瓜蛋白酶加入量为4000 U/g湿重计紫菜蛋白,充分混合均匀后65℃酶解4 h,反应过程中保持pH的稳定;酶解结束后,煮沸灭酶15 min,静置冷却后以10000 r/min的速度离心15 min,弃去沉淀得到含有紫菜蛋白抑菌肽的上清液;(2)紫菜蛋白抑菌肽的纯化制备:c、DEAE‑52阴离子交换层析:采用阶段洗脱的方法,流动相:0‑74 min用10mmol/mL的平衡液洗脱,平衡液为pH6.8的Na2HPO4‑柠檬酸溶液,74‑120 min用含有0.2mol/mL的NaCl溶液洗脱,120‑200 min用含有0.4mol/mL的NaCl溶液洗脱,200‑250min用含有0.6mol/mL的NaCl的溶液洗脱;流速均为1 mL/min,检测波长:220 nm;收集各峰组分,并对收集的各峰组分浓缩至紫菜蛋白抑菌肽浓度为6mg/mL后进行抑菌活性比较,取抑菌活性较好的离子交换层析峰组分冷冻干燥备用;d、Sephadex G‑25凝胶层析:取上述步骤c冷冻干燥的抑菌活性较好的离子交换层析峰组分溶解在超纯水中,浓度为0.1mg/mL;采用Sephadex G‑25凝胶层析柱经超纯水平衡后,进样量2mL,用超纯水进行洗脱;检测波长为220 nm,流速:0.5mL/min,80min后不再出峰,收集各峰组分,并对各峰组分浓缩至紫菜蛋白抑菌肽浓度为6mg/mL后进行抑制剂活性比较,取抑菌活性较好的凝胶层析峰组分冷冻干燥,即得产品紫菜蛋白抑菌肽。
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