[发明专利]CRISPR‑Cas9靶向敲除乙肝病毒cccDNA及其特异性sgRNA

摘要

本发明属于基因工程领域，更具体地说，涉及CRISPR‑Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法以及用于特异性靶向乙型肝炎病毒cccDNA的sgRNA。本发明提供了CRISPR‑Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法以及用于特异性靶向乙型肝炎病毒cccDNA的sgRNA。利用本发明制备的特异性靶向乙型肝炎病毒cccDNA的sgRNA能够精确靶向乙型肝炎病毒cccDNA并且实现基因敲除。该制备方法步骤简单、sgRNA靶向性好，CRISPR‑Cas9系统的敲除效率高。

主权项

CRISPR‑Cas9特异性敲除乙型肝炎病毒cccDNA的方法，该方法用于非诊断或治疗目的，其特征为包括如下步骤：(1)提供sgRNA，所述sgRNA在乙型肝炎病毒cccDNA上的靶序列符合5’‑N(21)GG的序列排列规则，所述sgRNA在HBV cccDNA的靶向位点位于S蛋白的ORF，所述sgRNA在HBV cccDNA的上的靶序列是唯一的，并且所述sgRNA对应的DNA序列如序列表SEQ ID NO.30‑33任意一条序列所示，在所述sgRNA对应的DNA链5’加上CCGG合成得到正向寡核苷酸即Forward oligo；获得所述sgRNA对应DNA的互补链，并且在互补链的5’加上AAAC合成得到反向寡核苷酸即Reverse oligo；将合成的1对互补的sgRNA寡聚核苷酸的forward oligo和reverse oligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入U6真核表达载体的双链sgRNA寡聚核苷酸；(2)线性化序列如序列表SEQ ID NO.12所示的pGL3‑U6‑sgRNA质粒；将退火的双链sgRNA寡聚核苷酸与线性化pGL3‑U6‑sgRNA质粒连接获得pGL3‑U6‑HBV sg质粒；pGL3‑U6‑HBV sg质粒转化感受态细菌并涂Amp+平板，挑选单克隆并用序列如序列表SEQ ID NO.11所示的通用引物U6通过测序鉴定出阳性克隆；37℃摇床摇阳性克隆菌过夜并用货号为AP‑MN‑P‑250的AxyPrep Plasmid Miniprep Kit抽提pGL3‑U6‑HBV sg质粒；(3)用LipofectamineTM 2000Transfection Reagent装载pGL3‑U6‑HBV sg质粒和序列为SEQ ID NO.13的pST1374‑NLS‑flag‑Cas9‑ZF质粒，共转染携带乙型肝炎病毒cccDNA的细胞；(4)用T7EN1酶切检测和TA克隆测序确认乙型肝炎病毒cccDNA已经被敲除。