[发明专利]用于检测等位基因CYP2C19*3的引物组合及检测试剂盒

摘要

本发明提供一种用于检测等位基因CYP2C19*3的引物组合，所述引物组合包括上游引物p1、下游引物p2、基因延伸引物p3和p4，序列分别如Seq ID No.1‑4所示。本发明还提供含有所述引物组合的检测等位基因CYP2C19*3的试剂盒。本发明基于特异引物延伸和高分辨率熔解曲线的设计思路，可以在不进行特殊扩增后处理的前提下直接进行基因分型。本方法利用荧光染料识别延伸产物进行基因分型，无需使用特殊标记的探针，方法简单，成本低廉，易于在临床中推广。

主权项

一种用于非诊断目的检测等位基因CYP2C19*3的方法，其特征在于，将待测样本分成G、A两个反应管进行检测；G反应管中包含：待测样本基因组DNA、基因扩增上游引物p1、基因扩增下游引物p2、基因延伸引物p3、荧光染料、高保真DNA合成酶pfu、dNTP、PCR反应缓冲体系；上游引物p1：5’‑AATTGAATGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCC‑3；’下游引物p2：5’‑GGTTTCTCAGGAAGCAAAAAACTTG‑3’；基因延伸引物p3：5’‑TGGCCTTACCTGGATC‑3’；基因延伸引物p4：5’‑TGGCCTTACCTGGATT‑3’；其中基因延伸引物p3和p4的3’端带有修饰，所述修饰包括硫代修饰、C3封闭、磷酸修饰；A反应管中包含：待测样本基因组DNA、基因扩增上游引物p1、基因扩增下游引物p2、基因延伸引物p4、荧光染料、高保真DNA合成酶pfu、dNTP、PCR反应缓冲体系；在每个反应管中首先进行聚合酶链反应：利用引物p1和p2，在高保真酶pfu的催化下，对G636A位点目的区段进行扩增；反应中使用的p1和p2浓度不同，其中p1 0.1‑1μM，而p2 0.01‑0.1μM；通过扩增同时产生大量的目的区段双链DNA和目的区段正向单链DNA；由于p3和p4长度远短于p1和p2，且退火延伸温度较高；扩增过程中p3和p4无法结合于其配对的DNA模板，因此不参与，也不影响扩增反应；扩增反应结束后，G反应管和A反应管无需任何处理，直接在PCR仪上进行引物延伸反应；延伸反应的模板是扩增反应产生到正向单链DNA，延伸反应的催化酶是扩增反应后仍保持活性高保真pfu酶，延伸反应使用的dNTP和缓冲体系也与扩增体系相同；在G反应管中，延伸引物仅能识别636位为G的正向单链DNA，并生成延伸产物；在A反应管中，延伸引物仅能识别636位为A的正向单链DNA，并生成延伸产物；由于反应体系中存在荧光染料，通过高分辨率熔解曲线方法分析G反应管和A反应管中是否存在延伸峰即可确定G636A位点基因型；其中，所述方法中，使用具有3'到5'核酸外切酶的活性的高保真DNA聚合酶，以保证扩增的准确性；其中，所述方法中使用荧光染料识别延伸产物进行基因分型，从而无需使用特殊标记的探针；其中，所述方法中，通过在反应体系中引入基因延伸引物，进行G636A位点的特异延伸；其中，所述方法中，采用非对称PCR的方式进行基因扩增，从而同时得到双链基因扩增产物和单链基因扩增产物；其中过量的p1和限量的p2用于特异扩增G636A区段DNA。