[发明专利]一种黄酒用双功能酶交联酶聚集体的制备与应用

摘要

一种黄酒用双功能酶交联酶聚集体的制备与应用，属于酶制剂、酿酒添加剂技术领域。本发明从普罗威登斯菌（Providencia sp.）JNB815中提取具有降解尿素和氨基甲酸乙酯(EC)活性的游离脲酶粗酶液,证明该游离脲酶为具有脲酶和氨基甲酸乙酯降解酶活性的双功能酶。这种双功能酶利用无载体固定化技术制成交联酶聚集体，该交联酶聚集体应用于黄酒中，可同时去除其中的尿素和氨基甲酸乙酯。该交联酶聚集体对尿素的去除率初次使用可达85.35%，使用6次后尿素去除率仍能达69.30%。对EC的去除率最高可达46.27%，经交联酶聚集体处理后的黄酒，其挥发性风味物质无明显变化。

主权项

一种黄酒用双功能酶交联酶聚集体的制备方法，其特征在于步骤为：（1）游离脲酶提取：菌种普罗威登斯菌（Providencia sp.）JNB815；该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.8326；种子培养：种子培养基组成以g/L计：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，KH₂PO₄ 2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，用NaOH调pH 7.0，用纯水配制；接种量3%，37℃摇床培养8‑12 h，转速150 rpm；发酵培养：发酵培养基组成以g/L计：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，KH₂PO₄ 2，NaCl 5，NaAc 2，尿素5，四水硫酸锰0.05，六水硫酸镍0.05，HCl调pH5.5，用纯水配制；接种量5%，37℃摇床培养20‑24 h，转速150 rpm；以上菌种经种子培养、发酵培养后，所得发酵液在4℃、8000rpm离心5 min后，弃去上清液，所得菌体用去离子水洗涤两次，再用pH4.5、50mmol/L的柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液洗涤一次，8000r/min离心5min后获得全细胞；将获得的全细胞用柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液稀释到原发酵液体积的1/10，重新悬浮菌体，搅匀，进行超声波破碎；超声波破碎条件为300W、15min，破碎时间3s、间隔时间3s，处理量35mL；破碎液在4℃、10000rpm离心20min，收集上清液，即得到游离脲酶粗酶液；（2）游离脲酶的纯化：a、乙醇分级沉淀：将步骤（1）中由（Providencia sp.）JNB815所提取的游离脲酶粗酶液，依次采用质量浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%及90%的乙醇分级沉淀，10000r/min离心20min，所得沉淀复溶于pH6.8、25mmol·L^‑1磷酸钠缓冲液中，测定上清液的酶活并绘制醇沉曲线；b、DEAE‑FF离子交换层析：DEAE‑FF层析柱预先以pH6.8、25mmol·L^‑1磷酸钠缓冲液平衡完全，将5mL醇沉得到的酶液上样，用所述磷酸钠缓冲液配制的0～1.0 mol·L^‑1的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速1.0 mL·min^‑1，收集蛋白峰，测定各峰脲酶和EC降解酶酶活，合并有酶活部分，4℃保存备用；c、Superdex 200凝胶过滤层析：以pH6.8、25mmol·L^‑1磷酸钠缓冲液平衡Superdex 200层析柱2～3个柱体积，完全平衡后，将1mL步骤b收集的酶液加到层析柱上，以磷酸钠缓冲液进行洗脱，收集、合并有酶活部分，超滤浓缩得到纯化后的游离脲酶，4℃保存备用；（3）交联酶聚集体的制备：步骤（2）c所得游离脲酶用质量浓度为10%的乙醇去除杂质后，采用终浓度为60%的乙醇进行沉淀，所得沉淀复溶于5mL含60%乙醇的pH4.5、50mmol/L的柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液中，加入反应体系总体积的0.3%，m/v，的京尼平，室温下进行交联2.5h，混合溶液放置到4℃冰箱中生成交联酶聚集体CLEAs；在10000 r·min^‑1离心20min后弃上清，沉淀用超纯水洗涤两次，离心获得交联酶聚集体CLEAs，于4℃冰箱中贮存。