[发明专利]一种荧光素酶‑多抗原融合蛋白以及蛋白A琼脂糖‑融合蛋白‑抗体复合物

摘要

本发明提供一种可同时检测四种I型糖尿病自身免疫抗体的方法，属于医学检测技术领域，将荧光素酶基因与多抗原基因融合成融合载体，然后利用细胞转化技术，将融合载体导入哺乳细胞系统中，进行荧光素酶—多抗原融合蛋白的表达；裂解基因重组细胞，获得荧光素酶‑多抗原融合蛋白；然后利用免疫沉淀反应，将荧光素酶‑多抗原融合蛋白稀释液与病人血清混合进行特异性结合，获得融合蛋白‑抗体复合物，再加入蛋白A琼脂糖捕捉融合蛋白‑抗体复合物；加入荧光素酶底物，检测荧光强度。该方法快速简便、准确率高，克服现有技术使用放射性标记物所引起的放射线辐射和污染等问题，高灵敏度、高信噪比，测量值稳定可靠。

主权项

荧光素酶‑多抗原融合蛋白，其特征在于：该荧光素酶‑多抗原融合蛋白通过以下步骤获得：A、荧光素酶基因与多抗原基因的融合载体的构建a、选取荧光素酶基因和多抗原基因的目的序列：GAD65抗原基因序列、IA‑2a抗原基因序列、IA‑2b抗原基因序列和insulin抗原基因序列，进行PCR扩增，在kpnl位点GGTACC引入限制性内切酶，获得目的片段，做凝胶电泳进行鉴定；b、将获得的目的片段与PA0815载体质粒分别进行kpnl和xbal双酶切，并使用T4连接酶将目的基因与载体基因连接得到重组质粒；B、质粒转化将重组质粒转入制备好的感受态哺乳细胞系统中，在氨苄耐药基因平皿中筛选阳性克隆，从转化细胞内提取质粒DNA，然后质粒DNA进行PCR鉴定及kpnl和xbal双酶切鉴定；C、融合蛋白的获取挑取单菌落至含有8%～15% I型糖尿病的病人血清的DMEM培养液中27℃～31℃下培养50～60h，于0～4℃，6000～8000rpm离心15～20min；将得到的细胞沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤并离心2～3次，最后将收获的细胞在冰浴中超声处理15～30 min，然后将细胞裂解液于0～4℃，最大转速离心15～45 min后取上清液；D、重组融合蛋白的纯化把步骤C所得上清液，用硫酸铵沉淀法进行分级沉淀，沉淀物经0.05～0.08 mol/L Tris‑Hcl缓冲液冲洗2～3次，后冻干备用；即得荧光素酶‑多抗原融合蛋白。