[发明专利]基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系及其应用

摘要

本发明涉及一种基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系及其应用，该扩增体系在现有第二代超分支滚环扩增技术的基础上，通过引入一种特殊的核酸内切酶，即切刻内切酶Nb.BsrDI，从而发展出第三代滚环扩增技术，即网状滚环扩增技术（NRCA）。本发明的网状滚环扩增所产生的荧光信号强度随靶标DNA浓度的增加而增加，并且荧光信号强度明显高于线性滚环扩增和超分支滚环扩增，检测限达到0.1fM。该技术与第一代线性滚环扩增和第二代超分支滚环扩增相比，不仅保持了原有技术在操作性、使用成本、扩增所需时间等方面的优势，而且在原有技术基础上进一步实现了信号放大，从而为超低丰度核酸样本的分析检测提供了良好的技术条件，其应用前景非常广阔。

主权项

一种基于切刻内切酶的网状滚环扩增体系，其特征在于 该网状滚环扩增体系中有组成及浓度为：环状DNA模板                                                  100 nM；靶标DNA                                                          1 μM；引物                                                                    1 μM；dNTP                                                                  400 μM；Bst DNA聚合酶大片段                                    8 U；切刻内切酶Nb. BsrDI                                      10 U；1×Bst DNA聚合酶大片段缓冲溶液                      v/v；所述的环状DNA模板是包含了三部分序列的环状碱基序列，第一部分是与标靶DNA序列互补的序列；第二部分是包含有切刻内切酶Nb. BsrDI的识别位点的所述的引物的序列相同的碱基序列；第三部分是随机序列，用于将第一部分序列与第二部分序列进行连接； 所述引物能与线性滚环扩增的产物结合，在Bst DNA聚合酶的作用下延伸并置换下游引物的延伸产物；所述的1×Bst DNA聚合酶大片段缓冲溶液中含有20 mM Tris‑HCl，10 mM KCl，10 mM （NH₄）₂SO₄，2 mM MgSO₄，0.1% Triton X‑100，其pH 8.8。