[发明专利]一种分离真盐生植物内生细菌的方法

摘要

本发明涉及一种分离获得真盐生植物内生细菌的方法，该方法是由配制培养基、植物预处理、表面消毒、二次剪切和破碎、内生细菌的分离和培养过程步骤完成，将真盐生植物表面消毒、二次剪切选取最佳部位后机械破碎真盐生植物组织，涡旋高速震荡分离内生细菌，通过特殊培养基低温培养内生细菌。本发明与现有方法相比，不仅可利用费用低廉的机器快速破碎真盐生植物组织，涡旋震荡使真盐生植物组织中的内生细菌释放更加充分，而且通过特殊培养条件提高得率，从而在种类和数量上均获得更好的真盐生植物内生细菌分离效果，以期尽可能获得真盐生植物体内所有的内生细菌，克服已有技术中的局限性。

主权项

一种分离真盐生植物内生细菌的方法，其特征在于按下列步骤进行：a、配制培养基：取5‑15克真盐生植物盐角草、梭梭、囊果碱蓬、盐爪爪、里海盐爪爪、盐穗木或盐节木组织为同化枝、茎和根，剪碎后在100mL水中煮沸10‑30min，温度95‑100℃，再将煮沸液通过3‑4层纱布过滤，收集滤液，用10‑20 mL蒸馏水冲洗植物残渣通过1‑2层纱布过滤，收集冲洗液，将冲洗液加入收集的滤液中使总体积为100 mL，得到混合液，再将混合液与常规的R2A固体培养基按体积比为混合液∶R2A固体培养基 = 1∶10混合，温度121℃灭菌15‑20min后，制成平板；b、植物预处理：将真盐生植物盐角草、梭梭、囊果碱蓬、盐爪爪、里海盐爪爪、盐穗木或盐节木组织经超声清洗后，切成4‑6cm片段；c、表面消毒：将步骤b的片段进行表面消毒，先用有效氯浓度为3.5%次氯酸钠溶液浸泡消毒3‑3.5min，再用体积分数为75%乙醇溶液浸泡消毒3‑3.5min，浸泡后用无菌水冲洗5次去除残余表面消毒液，选取第5次洗涤后的水涂布检测消毒结果；d、二次剪切和破碎：经步骤c表面消毒后的真盐生植物片段用无菌滤纸吸干表面水分，在无菌条件下将真盐生植物片段两侧0.5‑1cm边缘切除，然后将剩余部分剪切成0.5‑1cm小段，放入温度0‑4℃预冷处理30min‑60min的无菌干磨杯中，使用搅拌刀头刀片数为2‑5片，功率为300W‑350W的搅拌机充分打碎；e、内生细菌的分离：在无菌条件下，取1g真盐生植物组织碎片转入装有9mL无菌质量百分含量为0.85%生理盐水的离心管中，置于涡旋震荡器上，在转速为2000rpm‑3000rpm、室温条件下震荡10s‑60s，取上清液；f、培养过程：在无菌条件下，将步骤e得到的200μL上清液用无菌生理盐水进行10‑100倍的稀释，再将稀释液涂布于步骤a制备的平板上，将平板于温度15℃恒温培养14‑20天后，挑取不同形态的菌落，纯化即得真盐生植物内生细菌。