[发明专利]表达人血清白蛋白的慢病毒载体及其构建方法

摘要

本发明公开了一种表达人血清白蛋白的慢病毒载体包含有人血清白蛋白基因，以及进行人血清白蛋白表达调控的鸡源的鸡卵清蛋白的启动子区序列，如SEQIDNO.3所示，人血清白蛋白基因的5’端连接有kozak序列；同时，上游还包含有进行药物筛选的neo基因，下游包含有报告基因ZsGreen。本发明的表达人血清白蛋白的慢病毒载体可用于制备转基因鸡，该转基因鸡繁殖后，其产生的卵(鸡蛋)中将会特异性地表达人血清白蛋白，而转基因鸡的其它细胞并不会表达人血清白蛋白，分离纯化方便，且由转基因鸡生产出来的人血清白蛋白在经过修饰之后更近似于人类体内正常的血清白蛋白，更有利于其发挥生物学功能。

主权项

表达人血清白蛋白的慢病毒载体的构建方法，其特征在于：设计特异性引物，进行鸡卵清蛋白的启动子区序列和人血清白蛋白基因的扩增；然后，用pBluescriptIISK(+)载体构建鸡卵清蛋白的启动子区序列与人血清白蛋白基因融合，然后将融合基因经过PCR扩增后连接到修饰的pLVX‑Neo‑IRES‑ZsGreen慢病毒载体上，即得表达人血清白蛋白的慢病毒载体；所述修饰的pLVX‑Neo‑IRES‑ZsGreen慢病毒载体是通过以下方法得到的：通过限制性核酸内切酶Nsil和BamHI对载体进行酶切，酶切后的载体经过T4DNA连接酶补平末端后连接成环状，即得；所述鸡卵清蛋白的启动子区序列如SEQ ID NO.3所示，人血清白蛋白基因序列如SEQ ID NO.2所示；所述用pBluescriptIISK(+)载体构建鸡卵清蛋白的启动子区序列与人血清白蛋白基因融合的具体方式为：鸡卵清蛋白的启动子区序列重组到pBluescriptIISK(+)载体上，再将人血清白蛋白基因重组到pBluescriptIISK(+)载体上，利用特异性引物将鸡卵清蛋白的启动子区序列与人血清白蛋白基因的融合基因克隆下来；所述特异性引物如下：用于扩增鸡卵清蛋白的启动子区序列的引物为F1、F2：F1：5’‑CCGCGGCCGCTCTATGGCGTCAAAGGTCA‑3’；如SEQIDNO.4所示；F2：5’‑CCCCCCGGGGAAAATGTAAGGATGG‑3’；如SEQIDNO.5所示；用于扩增人血清白蛋白基因的引物为F3、F4：F3：5’‑CCCGGGGCCGAAATGAAGTGGGTAACCTTTAT‑3’；如SEQIDNO.6所示；F4：5’‑CCATCGATTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC‑3’；如SEQIDNO.7所示；引物F5，F6用于将连接到pBluescriptIISK(+)载体上的鸡卵清蛋白的启动子区序列+人血清白蛋白基因克隆并重组到pLVX‑Neo‑IRES‑ZsGreen：F5：5’‑CCGCTCGAGGCTCTATGGCGTCAAAGGTC‑3’；如SEQIDNO.8所示；F6：5’‑CCGGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTT‑3’；如SEQIDNO.9所示。