[发明专利]基于一氧化氮合成酶NOS的重金属铜细胞毒性的检测方法

摘要

一种重金属毒性技术领域的基于一氧化氮合成酶NOS的重金属铜细胞毒性的检测方法，利用重金属铜可以通过取代NOS二聚体中的锌离子和钙离子，使NOS二聚体解聚，NO合成量下降，NOS的mRNA表达出现反馈性的上调；另一方面，NOS二聚体的解聚伴随着NOS的单体数量上升，细胞内活性氧含量上升，细胞翻译起始因子磷酸化，蛋白合成停止，最终导致细胞凋亡的毒性机制，将一氧化氮合成酶NOS用于重金属铜细胞毒性的检测，为重金属污染的生物安全性评估和治疗重金属中毒及其相关疾病的防治提供新的解决方案。

主权项

一种一氧化氮合成酶NOS的应用，其特征在于，利用重金属铜能够使其二聚体解聚的特性，将其用于重金属铜细胞毒性的检测，包括以下步骤：1)模式细胞的培养，该细胞为人乳腺癌MCF‑7细胞用含10％胎牛血清的普通含酚红DMEM培养基在37℃、5％CO2培养箱中培养；实验前细胞接种于35mm培养皿，24h,贴壁；2)使用步骤1的模式细胞进行产物NO的检测，具体是指：1mM重金属铜暴露30min后，裂解细胞，10000rpm，4℃离心5min，取各管上清液50μL于96孔板，一氧化氮检测试剂盒检测产物NO，540nm测定吸光度，根据标准曲线计算细胞内NO含量；3)根据步骤2的结果进行细胞内锌离子和钙离子的检测，具体是指：1mM重金属铜暴露30min后，Ca2+指示剂Fluo‑3/AM孵育40min,检测荧光信号，激发波长：488nm,发射波长：525nm；50μM TSQ探针孵育30min，检测荧光信号，激发波长：334nm,发射波长：485nm；4)根据步骤2的结果进行NOS的mRNA表达检测，具体包括：4.1)1mM重金属铜暴露后，用高纯总RNA快速提取试剂盒提暴露后细胞总RNA；4.2)取500ng总RNA，用反转录试剂盒，37℃反应15min，再85℃5s使反转录酶失活；4.3)实时定量PCR定量，用2‑ΔΔCt方法分析基因的相对表达量，基因扩增的特异性由熔解曲线保证，PCR反应条件为95℃预变性30s，PCR循环如下：95℃变性5s，60℃延伸34s，40个循环；5)根据步骤4的结果进行NOS的蛋白表达及细胞翻译起始因子磷酸化表达的检测，具体是指：1mM重金属铜以及1mM重金属铜和25mM LNAC共处理后，收集细胞，完全裂解细胞，12000rpm，4℃，离心3min，吸取上层清液，测蛋白浓度，上样，电泳，200V，跑35min；转膜，150V，50min；封闭30min；一抗nNOS，eNOS，iNOS，β‑actin，p‑elF2α，4℃，摇床孵育过夜；辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育30min；显影，成像；6)根据步骤5的结果进行细胞内活性氧含量的检测,具体是指：1mM重金属铜，1mM重金属铜和10mM L‑Arg，1mM重金属铜和25mM LNAC共处理后，10mM DHR，37℃孵育5min，检测荧光信号，激发波长：488nm，发射波长：525nm；7)根据步骤6的结果进行细胞活性检测，具体是指：1mM重金属铜，1mM重金属铜和10mM L‑Arg，1mM重金属铜和25mM LNAC共处理后，每孔加20μL噻唑蓝溶液5mg/mL，孵育4h，弃掉各孔中溶液，每孔加入150μL二甲基亚砜，振荡10min，测定吸光度490nm，吸光度与细胞活性成正比；8)根据步骤1‑7实现重金属铜作用下NO合成量的下降与细胞活性降低之间具有信号通路的关联性，从而按照重金属铜作用下，30分钟时刻NO合成量的下降百分比作为重金属铜细胞毒性的检测结果。