[发明专利]结核分枝杆菌融合蛋白EAMMH、其构建、表达和纯化方法及其应用

摘要

本发明公开了结核分枝杆菌融合蛋白EAMMH，同时还提供了其构建、表达和纯化方法及其应用。该融合蛋白以可溶形式表达，明显改善了EAMM以包涵体进行表达的缺点。该融合蛋白与佐剂联合构建的结核亚单位疫苗（LT69）具有较强的免疫保护力，优于传统的BCG疫苗及EAMM＋MH联合疫苗；该疫苗作为加强型疫苗可以明显增强BCG初始免疫的免疫力及抗结核的保护效果，并且一定程度上减轻肺脏的病理损伤；此外，该亚单位疫苗包含了结核分枝杆菌生长期和潜伏期的多种抗原，可诱导较强的针对各期结核菌抗原的特异性细胞免疫和体液免疫应答，对不同代谢状态的结核菌均据有防护作用，且保护时间长，有望成为临床结核病预防的有效疫苗。

主权项

一种结核分枝杆菌融合蛋白的制备方法，其特征在于，是将融合抗原EAMM和单个抗原HspX进行基因水平的融合，构建重组载体pET30a(+)‑EAMMH，再将pET30a(+)‑EAMMH质粒载体转化入大肠杆菌E. coli中进行融合蛋白EAMMH的表达，通过盐析和柱层析的相结合的方法纯化结核分枝杆菌融合蛋白；所述结核分枝杆菌融合蛋白的氨基酸序列如序列2所示；编码所述结核分枝杆菌融合蛋白的核苷酸序列如序列1所示；包含有编码所述结核分枝杆菌融合蛋白的核苷酸的载体为重组基因载体pET30a(+)‑EAMMH，所述EAMMH即为核苷酸 ESAT6‑Ag85B‑MPT64190‑198‑Mtb8.4‑HspX；包含有所述载体的宿主细胞为大肠杆菌BL21（DE3）；具体制备过程包括以下步骤：1）融合蛋白EAMMH表达质粒pET30a(+)‑EAMMH的构建：①构建重组基因载体pET30a(+)‑MPT64190‑198‑Mtb8.4‑HspX (MMH)：以现有构建成功的pET30a(+)‑Mtb8.4‑HspX（MH）重组基因序列为模板，设计引物扩增MPT64190‑198‑Mtb8.4‑HspX(MMH)基因片段；引物分别为：上游引物5’‑3’如序列3所示；下游引物5’‑3’如序列4所示；以pET30a(+)‑Mtb8.4‑HspX（MH）质粒为模板，以上述两条引物，PCR扩增出MPT64190‑198‑Mtb8.4‑HspX（MMH）融合基因产物，该PCR产物经纯化后，用Bgl II和Hind III进行双酶切，克隆构建在质粒pET30a(+)上， 构建成pET30a(+)‑MPT64190‑198‑Mtb8.4‑HspX（MMH）载体；②构建重组基因载体pET30a(+)‑ESAT6‑Ag85B‑ MPT64190‑198‑ Mtb8.4‑HspX（EAMMH）：以现有构建成功的pET30a(+)‑ESAT6‑Ag85B（EA）重组基因序列为模板，设计引物扩增ESAT6‑Ag85B（EA）基因片段；引物分别为：上游引物5’‑3’如序列5所示；下游引物5’‑3’如序列6所示；以pET30a(+)‑ESAT6‑Ag85B（EA）质粒为模板，用上述两条引物，PCR扩增出ESAT6‑Ag85B（EA）融合基因产物，该PCR产物经纯化后，用Nde I和Bgl II进行双酶切，克隆构建在质粒pET30a(+)‑MPT64190‑198‑Mtb8.4‑HspX（MMH）上，构建成pET30a(+)‑ESAT6‑Ag85B‑ MPT64190‑198‑ Mtb8.4‑HspX（EAMMH）载体；2）融合蛋白EAMMH的表达与纯化：a）融合蛋白EAMMH的表达：将上述构建成功的pET30a(+)‑ESAT6‑Ag85B ‑MPT64190‑198‑ Mtb8.4‑HspX（EAMMH）载体转化入表达载体大肠杆菌BL21（DE3）中，活化表达EAMMH蛋白的大肠杆菌BL‑21(DE3)菌体，取1ml活化后菌体加入200ml LB培养基中震荡培养3小时10 分钟；加入1.0mmol/L的蛋白诱导剂IPTG 100μl，25℃诱导振荡培养12h；4℃ 10000rpm/min离心10min收集菌体；菌体重悬于PB缓冲液10ml/g湿菌，PB缓冲液组成为Na2HPO4·12H2O 20mmol/L，Na2HPO4·12H2O 20mmol/L，pH7.4，冰浴下超声破碎细菌1h，超声功率为180～200 W，超声4s后停5s ；10000rpm/min离心20min 后分别收集上清和沉淀，将上清和沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；b）融合蛋白EAMMH上清的纯化：大量表达融合蛋白EAMMH，收集的菌体重悬于20mM PB缓冲液中，冰浴下超声破碎1h，4℃ 10000rpm/min离心10min，离心后收集含EAMMH蛋白的上清；上清用0.45μm滤器过滤除菌；将该融合蛋白分别以饱和度8%，6%，4%的2%的硫酸铵溶液进行梯度盐析；盐析出的蛋白以含有助溶剂的20mM pH7.4的PB缓冲液进行重悬，所述助溶剂中含有0.4%精氨酸和1M的尿素；将所收取的融合蛋白进行分子筛层析；以凝胶过滤介质Superdex 75 pre grade收集各梯度洗脱液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析得最终纯化物；c）融合蛋白EAMMH沉淀的纯化：先用洗涤缓冲液洗涤包涵体三次，去除包涵体以外的杂蛋白，洗涤缓冲液包含有20mM Tris－HCl、0.5 mol/L NaCl、2 mol/L尿素和1%triton‑X‑100，其pH值为8.0；再用溶解缓冲液溶解包涵体30分钟，溶解缓冲液中含有20mM Tris‑HCl和8M尿素，之后用0.45μm的滤器过滤去除未溶解的包涵体，将溶解完全的包涵体在透析缓冲液中进行梯度透析复性；将透析复性之后的包涵体进行离子交换层析和疏水层析，进行进一步的纯化；在柱层析过程中，采用离子交换介质DEAE和疏水介质phneuyl FF；最后，将最终的纯化产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯度。