[发明专利]鉴定转基因植物中目标基因拷贝数并筛选低拷贝植株的方法

摘要

本发明提供一种高通量鉴定转基因植物中目标基因拷贝数并筛选低拷贝植株的方法，采用Real‑Time实时荧光定量PCR技术，选取合适的物种标准化基因(即内参基因)，与外源基因进行相对定量的检测，通过二者的扩增曲线，计算外源基因拷贝数，再结合传统的Southern杂交技术，对获得的拷贝数进行校正。按照对转基因作物不同拷贝数的需求，通过本方法，可以快速、高通量的检测和筛选到转基因作物中所需的拷贝植株。

主权项

1.一种高通量鉴定转基因植物中目标基因拷贝数并筛选低拷贝植株的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提取待测转基因植物基因组DNA；2)筛选目标基因荧光定量PCR引物与内参基因荧光定量PCR引物，保证目标基因和内参基因扩增效率一致；3)以转基因植物的基因组DNA为模板，分别用目标基因引物和内参基因引物进行荧光定量PCR；指定一个荧光信号阈值，根据目标基因和内参基因的循环次数的差值，确定待测转基因植物中的目标基因的拷贝数；4)筛选低拷贝转基因植株；5)通过Southern杂交技术，对获得的拷贝数进行校正；其中，所述转基因植物是转基因水稻，所述目标基因是抗草甘膦基因Epsps‑CP4，所述内参基因是水稻Actin7基因；所述目标基因荧光定量PCR引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.5和6所示，所述内参基因荧光定量PCR引物包括正向引物和反向引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.9和10所示；对转基因水稻进行荧光定量PCR扩增时，反应体系为：FastStart Universal SYBR Green Master[ROX]5μl，300nM的正、反向引物各1.25μl、模板DNA 2.5μl；反应程序为：95℃10min；95℃10sec，60℃30sec，共28个循环；步骤3)中荧光信号阈值为0.2，RQ值为0.1‑1.5。