[发明专利]一种36bplox位点序列的重组载体及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种36bplox位点序列的重组载体及其构建方法与应用，利用Sac I和Sma I内切酶切除pBI121载体中的GUS基因。设计特定引物lox66-Cre-5’和Sac I-cre-3’，利用LA-Taq酶扩增J20(Pc-cre，包含有Cre基因序列)获得lox66-Cre片段。利用T4连接酶将lox66-Cre片段连入除去GUS基因的pBI121载体，经鉴定40号克隆为所需要的阳性克隆，命名为Cre40，Cre40为含有CRE/loxP位点特异性重组系统的表达载体。通过根癌农杆菌介导，将表达载体Cre40转化油菜品种中油821，获得了经过PCR检测为阳性的油菜转基因植株，转基因植株有性杂交试验证明该载体具有位点特异性重组功能。

主权项

一种36bplox位点序列的重组载体及其构建方法，其特征在于，包括以下步骤：第一步：MS培养基配方：铁盐成分：FeSO₄·7H₂O        27.8mg/L          Na₂‑EDTA·2H₂O     37.3mg/L，以上溶液均配成100×的母液；第二步：筛选培养基：MS+3mg/L6‑BA+0.1mg/L NAA+5mg/L AgNO3+400mg/L Car+13mg/L卡那霉素，生根培养基：MS+0.2mg/LNAA+400mg/L Car+15mg/L卡那霉素，YEB培养基：牛肉膏(5g/L)，酵母抽提物(1g/L)，蛋白胨(5g/L)，蔗糖(5g/L)，MgSO₄(2mmol/L)pH7.2，固体培养基含琼脂15g/L，LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，调整PH至7.0，再补足水至1L，固体培养基含琼脂15g/L；第三步：质粒DNA的酶切及其产物的纯化，第四步：DNA的连接；第五步：连接产物的重组子鉴定。