[发明专利]一种具有抗凝血与溶血栓地龙多肽及其酶解制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种具有抗凝血与溶血栓地龙多肽及其酶解制备方法与应用，制备方法包括地龙干体清洗干燥，粉粹成粉；加水搅拌，离心，得蛋白沉淀；将蛋白加水溶解，加入碱性蛋白酶，酶体积与蛋白重量之比0.1~3mL100g，搅拌；灭酶活，加入胰蛋白酶，酶质量与蛋白重量比0.5~5g100g，温度25~60℃，搅拌；酶解液过阴离子交换柱，收集部分洗脱液；再过大孔吸附树脂，分离纯化，收集干燥，得地龙抗凝血肽粉。本发明为高活性抗凝血类活性物质增加了新来源，具有产品活性高、制备过程方便可行、环保等优点，可作为预防血栓、溶血栓、降血稠类食品的原料，辅以乳糖、甘露醇等，制成粉剂、片剂、胶囊或口服液。

主权项

一种具有抗凝血与溶血栓地龙多肽的酶解制备方法，其特征在于，包括如下步骤：取500g地龙干粉，按照干粉与水的比例为35g：100 mL，pH调至9.6，以250 r/min的速度均匀搅拌4h，取上清液，再将pH调至4.6，最后得到蛋白沉淀，将其pH调至7.0，干燥，制得地龙蛋白；将地龙蛋白加入水中溶解，蛋白与水的比例为25g：100 mL，控制pH值在8.5，再加入Alcalase 2.4L碱性蛋白酶，酶体积与地龙蛋白重量之比为1.0 mL：100 g，反应温度为60℃，搅拌速度为300 r/min，反应时间 1.5h；再煮沸10min；再将pH值调至8.0，加入胰蛋白酶，酶与地龙蛋白重量之比为2 g：100 g，反应温度为40℃，搅拌速度为300 r/min，反应时间2h，煮沸10min；将酶解液过DEAE sepharose FF阴离子交换柱，从纯净水开始逐渐增大NaCl浓度，以0~1.0 mol/L不同浓度NaCl进行线性梯度洗脱，流速控制在0.8mL/min，在波长214 nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集第3、4洗脱组分洗脱液；再过DA201‑C大孔吸附树脂交换柱，从纯净水开始逐渐增大乙醇浓度，以0, 25, 50, 75, 100%不同浓度乙醇进行梯度洗脱，流速控制在1.0mL/min，在波长214 nm处测定吸光度，以吸收峰来分别收集75%乙醇洗脱组分洗脱液，冷冻干燥得到具有抗凝血与溶血栓地龙多肽。