[发明专利]恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒及核苷酸序列

摘要

本发明涉及一种恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒及核苷酸序列，设计了恶性疟原虫特异的引物和探针，优化了实时荧光PCR检测体系；针对恶性疟原虫的一对引物，结合普通PCR技术和分子克隆技术，构建了恶性疟原虫质粒标准品，建立了目的基因拷贝数与荧光检测信号之间关系的标准曲线，实现了恶性疟原虫的实时荧光定量检测。本试剂盒将纳米磁微粒分离疟原虫核酸技术与实时荧光定量PCR技术有机结合，在标本核酸提取方面具有操作方便、价廉、快捷、高效的特点，尤其在滤纸干血片核酸提取和提取微量全血核酸方面具有很大优势，实现了扩大检测范围、最大程度降低漏检率的目标，本试剂盒的检测限为25copies/μL。

主权项

一种恶性疟原虫纳米磁分离实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如下组分：Fe3O4纳米磁微粒、标本稀释液、裂解液、结合液、洗液、洗脱液、实时荧光PCR反应液、质粒标准品、阳性对照、阴性对照；所述的纳米磁微粒为用无水乙醇配制的纳米磁微粒溶液；所述标本稀释液为磷酸盐缓冲液PBS；所述裂解液为5M异硫氰酸胍、50mM Tris‑HCl、20mM EDTA、1％Triton X‑100，调节pH值至6.0；所述结合液为无水乙醇；所述洗液为70％乙醇；所述洗脱液为TE pH8.0；所述实时荧光PCR反应液包括上游引物F1，见序列1，下游引物R1，见序列2和荧光探针P1，见序列3；所述质粒标准品和阳性对照均为含有恶性疟原虫基因片段的质粒；所述的阴性对照为正常人全血核酸提取液；所述纳米磁微粒为表面修饰的纳米磁性粒子，其制备过程为：首先利用热分解法分解乙酰丙酮铁，合成Fe3O4纳米粒子，在碱性条件下水解四乙氧基硅烷，包裹Fe3O4纳米粒子，形成表面为硅羟基的纳米磁微粒。