[发明专利]一种延长水稻生育期的育种方法

摘要

本发明涉及一种延长水稻生育期的育种方法，包含以下步骤：在水稻生育期决定基因Ehd3外显子区选取靶标片段并构建植物CRISPR/Cas9打靶重组载体，导入水稻细胞并再生成苗；利用载体中的表达框实现对水稻细胞中Ehd3外显子区DNA的剪切，从而引起水稻细胞的自我修复；通过对再生株系基因组目标片段的测序，获取携带两个等位Ehd3基因同时发生功能缺失突变的株系，经过表型鉴定，确认再生植株生育期的延长。实验表明，本方法可快速获得生育期延长的水稻材料。

主权项

一种延长水稻生育期的育种方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： 步骤1，在水稻生育期决定基因Ehd3外显子区选取靶标片段，所述靶标片段的双链结构的一条链具有5’‑(N)_X‑NGG‑3’结构，(N)_X代表数目为X的一段碱基序列{N₁,N₂……N_x}，X代表碱基的数量，N₁,N₂……N_x中的每一个表示A、G、C、T中的任意一个，NGG中的N也表示A、T、G、C中的一种； 步骤2，利用所述靶标片段，构建用于水稻Ehd3基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，其中所述重组载体中包含具有所述靶标片段的向导RNA表达框，以及Cas9核酸酶表达框； 步骤3，将所述重组载体导入水稻细胞，诱导所述向导RNA表达框和所述Cas9核酸酶表达框在水稻细胞中共同表达； 步骤4，剪切Ehd3基因的双链靶标片段，诱发水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现细胞内Ehd3基因的功能缺失突变； 步骤5，用导入所述重组载体的水稻细胞再生水稻植株； 步骤6，对再生植株中Ehd3基因包含靶标片段的DNA区段测序。 步骤7，选择两个等位Ehd3基因都出现功能缺失突变的再生株系，进行表型鉴定，观察再生株系子代的生育期，挑取生育期推迟超过预定时间段的株系，作为所创制的生育期推迟的水稻材料。