[发明专利]用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂及其制作方法

摘要

本发明公开了一种能够提高青贮料的发酵品质和营养价值的用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂及其制作方法。所述添加剂由第一菌种和第二菌种混合而成，其中第一菌种为植物乳杆菌LP，第二菌种为乳酸乳球菌LL、融合魏斯氏菌WF、魏斯氏菌WB中的其中任意一种菌种，所述第一菌种与第二菌种的容积比例为1：（1～3）。在多花黑麦草进行青贮时，将乳酸菌添加剂添加到黑麦草青贮料中，可以大大提高青贮料的发酵品质和营养价值，所述的乳酸菌添加剂制作方法是通过从多花黑麦草本身附着的乳酸菌中分离出产酸能力强、生长旺盛且能提高多花黑麦草青贮料的发酵品质和营养价值的乳酸菌菌株，更加适宜多花黑麦草的贮存。适合在青贮领域推广运用。

主权项

用于多花黑麦草的青贮用乳酸菌添加剂制作方法，其特征在于包括以下步骤：A、制备乳酸菌培养基，将培养基各组分加入容器中，然后进行加热搅拌，待所有组分都充分溶解后，装入培养皿中并将其密封，然后将其放置于高压灭菌炉中进行灭菌处理，灭菌处理结束后，取出培养皿，将其放置于无菌操作台上，开启紫外灯对其照射一段时间，照射结束后吹风使培养基凝固；B、制备多花黑麦草的绿汁发酵液，将多花黑麦草原料剪切成2～3cm长的碎段，将切碎后的原料加入高速组织匀浆机中，再加入无菌蒸馏水进行搅碎，将搅碎的汁液用纱布过滤，用量筒称量滤液容积，加入相应重量的葡萄糖以使滤液中葡萄糖浓度达到20g/L，充分混匀后倒入容量瓶中，滤液要装满容量瓶且不留空气，将容量瓶盖子盖好并用胶布缠绕密封；C、从绿汁发酵液中分离、纯化乳酸菌，将步骤B制得的绿汁发酵液置于30℃恒温培养箱中厌氧发酵48h，从绿汁发酵液放置在30℃恒温培养箱中厌氧发酵开始，每隔4h在无菌操作台上打开一瓶绿汁发酵液，用接种针蘸少许中层发酵液后在培养基上进行划线，每瓶绿汁发酵液用三个培养基进行划线，直至第48h全部绿汁发酵液均进行过划线操作为止，将划过线的培养基放置在30℃的恒温培养箱中培养，每隔两天在无菌操作台上用接种针挑取培养基上的单个菌落得到纯的乳酸菌菌株；D、对挑取的单个菌落进行革兰氏染色并镜检，观察各个菌株在显微镜下的形态特征从而确定菌株的阴性和阳性；E、对纯的乳酸菌菌株进行生化鉴定，在无菌操作台上用接种针挑取单菌落置于含不同糖类的生化鉴定管中，将生化鉴定管用蜡密封后置于35℃恒温培养箱中培养24h，之后根据生化鉴定管中的显色反应并结合步骤D得出的结论对得到的菌株进行初步分类；F、对乳酸菌菌株进行分子鉴定，具体步骤如下：首先，提取乳酸菌菌株的基因组DNA，其次，对提取的基因组DNA进行PCR反应，得到琼脂糖凝胶，接着，从琼脂糖凝胶中回收DNA片段，得到PCR产物，最后，对得到的PCR产物进行测序，根据步骤E得出的结论，将测得的序列与Genbank中的已知序列进行比对，寻找同源性最高的菌种，从而确定菌株的类别；G、混合菌剂的制备，根据步骤F得到的鉴定结果，将需要选用的植物乳杆菌LP和魏斯氏菌WB的菌株分离出来接种于MRS液体培养基中，然后在30℃的恒温培养箱中培养24h，然后将各菌液稀释至1×10⁶cfu/mL，将植物乳杆菌LP作为第一菌种，魏斯氏菌WB作为第二菌种，按照第一菌种与第二菌种的容积比例为1：3混合制成乳酸菌添加剂。