[发明专利]检测猪流行性腹泻病毒抗体的ELISA试剂盒

摘要

本发明提供了一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的ELISA试剂盒，属于生物技术领域。该试剂盒是以纯化的重组猪流行性腹泻病毒N蛋白作为包被抗原的ELISA板条。RT-PCR方法扩增获得猪流行性腹泻病毒N基因，定向插入pET-28a载体构建pET-28a-N重组质粒，转化BL21（DE3）感受态细胞，获得原核表达菌pET-28a-N/BL21。经IPTG诱导表达、纯化，获得重组N蛋白。本发明试剂盒用于检测猪流行性腹泻病毒的抗体，经检验，该试剂盒特异性、敏感性、重复性均良好。该试剂盒检测准确、操作简便，适合于在临床应用中进行推广，为猪流行性腹泻病的快速检测提供了可靠手段。

主权项

 猪流行性腹泻病毒PEDV重组N蛋白，其制备方法包括以下步骤：（1）以猪流行性腹泻病毒PEDV的RNA作为材料，通过RT‑PCR方法扩增获得其N基因，基因登录号KC210145，扩增片段大小为1326bp，并以pET‑28a质粒作为载体构建重组质粒pET‑28a‑N，N基因与pET‑28a载体分别用BamH I与Sal I双酶切后，连接构建重组质粒pET‑28a‑N，双酶切鉴定重组质粒；将阳性重组表达质粒pET‑28a‑N转化BL21（DE3）感受态细胞，获得阳性质粒菌单克隆pET‑28a‑N/BL21；该单克隆于37℃培养，待A600值达到0.4~0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L进行诱导表达，收集诱导表达后5h的菌体，进行SDS‑PAGE鉴定，取诱导表达后5h的菌体，超声破碎，离心后分别取上清与沉淀进行SDS‑PAGE电泳鉴定，根据电泳结果，取上清表达液进行Western blot鉴定，大量诱导表达N蛋白，超声破碎，取上清表达液，使用Ni‑TED柱进行纯化，收集上清滤过液、LEW洗涤Ni‑TED柱所得洗涤液、1xElution Buffer洗脱所得纯化蛋白。