[发明专利]检测拟南芥叶片细胞数目的方法

摘要

本发明提供一种检测拟南芥叶片细胞数目的方法，包括植物叶片的酶解、细胞裂解与细胞核的收集、细胞核的染色与计数等步骤。通过流式细胞仪检测统计细胞核数目，从而确定拟南芥叶片细胞数目。与采用细胞计数板观察统计植物叶片细胞数目相比，本方法能计数整个植物叶片的细胞数目，具有操作方便，客观、精确的优势。

主权项

一种检测拟南芥叶片细胞数目的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)植物叶片的酶解：取1片拟南芥叶片，剪切成长0.5‑1.0mm、宽0.1‑0.2mm的小块，然后加入叶片酶解液0.5‑1mL，于20‑22℃，30‑40rpm黑暗酶解10‑12小时，至叶片酶解完全；2)细胞裂解与细胞核的收集：将酶解完全的叶片酶解液过300‑400目筛，然后以1400g‑1500g离心10‑12min，弃上清，加入溶液I溶解沉淀，将剪去顶端的枪头安装于移液枪上吹吸沉淀数次，直至沉淀完全溶解；然后将溶液于1400g‑1500g离心10‑12min，弃上清，向沉淀中加入预冷的细胞裂解缓冲液，再次将剪去顶端的枪头安装于移液枪上吹吸沉淀数次，直至混匀，冰浴5‑10min后，4℃1400g‑1500g离心10‑12min，弃上清，所得沉淀再次用预冷的细胞裂解缓冲液溶解，并重复上述步骤1‑3次，直至沉淀呈灰黑色；3)细胞核的染色与计数：向上述呈灰黑色的沉淀中加入细胞裂解缓冲液，将剪去顶端的枪头安装于移液枪上吹吸沉淀数次，直至沉淀完全溶解，然后加入等体积的染液II，混匀，冰浴30‑40min后，用孔径300‑400目的尼龙膜过滤，用流式细胞仪检测滤液中细胞核数目，从而获得叶片细胞数目；其中，步骤1)中所述叶片酶解液的配方为：1.5％纤维素酶、0.4％离析酶、20mM KCl、pH5.7的20mM MES、0.4M甘露醇、10mMCaCl₂、5mMβ‑巯基乙醇和0.1％BSA，以水配制；步骤2)中所述溶液I的配方为：pH5.8的0.03％MES、154mMNaCl、125mM CaCl₂、5mM KCl和5mM葡萄糖，以水配制；步骤2)和3)中所述细胞裂解缓冲液的配方为：15mM Tris、2mMNa₂EDTA、0.5mM四盐酸精胺、80mM KCl、20mM NaCl、0.5％TritonX‑100和15mMβ‑巯基乙醇，pH7.5，以水配制；步骤3)中所述染液II的配方为：100μg/mL PI、100μg/mL RNase和0.1％TritonX‑100，以磷酸缓冲液配制；所述磷酸缓冲液的配制方法为：取7.65g NaCl、0.725g Na₂HPO₄和0.212g KH₂PO₄，加入800mL水，调pH至7.4，然后定容至1L。