[发明专利]一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基及其应用

摘要

本发明涉及一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基的制备方法及使用该培养基快速鉴别结核分枝杆菌的方法、测定结核分枝杆菌对抗结核药的耐药性方法及使用该培养基中的液体培养基快速培养卡介苗的方法。本发明制备的双相培养基能用于结核分枝杆菌的快速培养，双相快速培养基能在2-5天鉴别出结核分枝杆菌，并且可利用反转录PCR方法对鉴别出的结核分枝杆菌进行利福平、异烟肼、链霉素抗结核药的耐药性检测，本发明制备的液体培养基可在6-9天完成卡介苗的培养。

主权项

一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基，其特征在于：培养基的制备方法如下：（1）固体培养基的制备：a.称取盐酸吡哆醇1～5mg、谷氨酸钠180～220mg、氯化钙10～20mg、硫酸镁15～25mg、柠檬酸铁铵80～120mg、柠檬酸钠180～220mg、硫酸铵380～420mg、丙酮酸钠950～1050mg、氯化铜1～10mg、氯化锌1～10mg、天门冬素1950～2050mg、磷酸二氢钾15～25mg和磷酸二氢钠15～25mg溶于蒸馏水600～700ml中，121℃加热15～20分钟，冷却至20‑25℃，得到固体培养基基础液；b.称取中性甘油8ml、1%孔雀绿水溶液15ml和鸡卵液1000ml加入步骤a所得固体培养基基础液中，混合均匀，分装于无菌培养管内，每管7～10ml；c.将b步骤所得无菌培养管于80～90℃加热10～20分钟，冷却至20‑25℃，得到固体培养基，将固体培养基于4℃保存备用；（2）液体培养基的制备：a.称取氯化钙1～10mg、硫酸镁5～15mg、油酸15～20mg、枸橼酸铁铵5～15mg、枸橼酸钠5～100mg、硫酸铵180～220mg、氯化铜1～10mg、氯化锌5～15mg、丙酮酸钠400～500mg、吐温‑80 0.5～1ml、天门冬素950～1050mg、磷酸二氢钾950～1050mg和磷酸二氢钠1750～1850mg溶于蒸馏水450～600ml中，121℃加热15～20分钟，冷却至20‑25℃，得到液体培养基基础液；b.称取盐酸吡哆醇0.15g、甘油5ml、酵母浸液4ml、过氧化氢酶0.2g、生物素0.15g、聚氧乙烯硬脂酸酯0.6g、牛血清白蛋白200g、酪蛋白消化物2g和分枝杆菌培养上清液5ml加入马铃薯汁500ml中，混合均匀，过滤除菌，得到促生长因子混合液；c.将步骤a所得液体培养基基础液与步骤b所得促生长因子混合液按体积比1:1混合均匀，得液体培养基混合液，向其中添加过滤除菌后的抑菌剂，得到液体培养基；所述的抑菌剂为多粘菌素B、氨苄青霉素和两性霉素B，且三者的质量与液体培养基混合液的质量体积比均为0.1mg/ml；（3）将步骤（2）所得液体培养基加入步骤（1）所得固体培养基中，液体培养基与固体培养基的体积比为1：1～1：3，得到结核分枝杆菌双相培养基；（4）在结核分枝杆菌双相培养基液体中加入噻吩‑2‑羧酸肼0.1ml或对硝基苯甲酸0.1ml，得到结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基。