[发明专利]基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法

摘要

本发明属生物技术和医学领域，涉及一种基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法，能克服传统的杂交测序方法假阳性高的缺陷，并解决现有方法探针合成量大、成本高昂、杂交探针短等问题，实现高通量，低成本，高灵敏度和快速测定短片段DNA序列。

主权项

一种基于连接酶反应的杂交高通量DNA测序方法，其特征在于确定未知DNA模板的碱基信息是通过DNA模板与多条标记DNA探针平行杂交并连接标记DNA探针，通过检测是否有标记物连接，根据碱基互补原理确定未知DNA模板是否有对应的四个或四个以上连续碱基的信息；即通过对DNA模板重复“杂交一连接一检测”步骤来实现；即DNA序列确定是通过一套一个末端包含有4个己知碱基的DNA杂交引物与一套标记DNA探针在连接酶的作用下平行地与待测DNA序列经过多轮连接、检测来实现；所述DNA杂交引物是5’p‑NNNN 3’或者5’NNNN3’；当所述DNA杂交引物是5’p‑NNNN 3’时，采用序列为序列1‑4的一套标记DNA探针；当所述DNA杂交引物是5’NNNN3’时，采用序列为序列5‑8的一套标记DNA探针；其中N为四种碱基T、A、G、C中任意一种或者通用碱基I，W、X、Y、Z均是选自T、A、G、C中的确定的一种碱基，构成序列确定的已知碱基末端；DNA杂交引物中XYZW组成256种不同序列，构成一套DNA杂交引物；所述DNA杂交引物，当已知碱基末端位于5’末端，为使连接反应能进行则该5’末端含有磷酸基团；当已知碱基末端位于3’末端，为使连接反应能进行则该3’末端含羟基基团且5’末端为非磷酸基团；所述方法包括如下步骤:步骤1)连接：混合DNA杂交引物中的一条与一套标记DNA探针及连接缓冲液，在连接酶的作用下，在DNA杂交引物的已知碱基末端连接上标记DNA探针；通过检测信号强度读取连接标记DNA探针的信息，确定未知DNA模板上的包含数个碱基的序列；步骤2)变性洗脱：用DNA变性试剂把待测DNA恢复单链DNA状态；步骤3)重复：再将另一末端已知碱基序列不同的DNA杂交引物按步骤1)与未知DNA模板杂交并进行步骤2)，确定未知DNA模板上的包含数个碱基的不同序列；用不同的DNA杂交引物重复上述过程，直到完成DNA序列测定；即确定未知DNA模板的DNA序列是根据DNA杂交引物己知碱基和所连接的标记DNA探针，通过碱基互补原理确定。