[发明专利]一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法

摘要

本发明涉及一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法，步骤如下：(1)制被待转化菌液；(2)制备转化后下胚轴；(3)初步筛选植株芽；(4)中度筛选植株芽；(5)深度筛选植株芽；(6)将深度筛选植株芽经培养后，制得转化植株。通过采用本发明所述的依次增加筛选压力的筛选方式，可以在丛生芽诱导的初始阶段除去大部分没有转化成功的丛生芽，以后每次继代培养都可去掉部分变白的假阳性植株，不仅节约了时间、大大降低了后期的工作量，而且能够保证最后得到的绿色植株绝大部分都是真正的阳性植株。

主权项

一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法，其特征在于，步骤如下：（1）挑取转染具有卡那抗性重组质粒或具有卡那抗性质粒的待转化的农杆菌单菌落接种于含卡那霉素和利福平的YEP液体培养基中，培养至对数生长期，经固液分离，收集菌体沉淀，经液体MS基本培养基重悬，制得待转化菌液；（2）切取花生幼苗的下胚轴，浸入步骤（1）制得的待转化菌液中进行转化，然后移至B培养基中，黑暗条件下共培养2～3天，经质量浓度为1%的头孢水溶液浸泡后，无菌水冲洗、晾干，制得转化后下胚轴；所述的B培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入0.6～0.8 mg NAA和7.5~8.5 mg 6‑BA；（3）将步骤（2）制得的转化后下胚轴移至C培养基中，经16h光照/8h黑暗条件下培养20～30天，挑取绿色植株芽，制得初步筛选植株芽；所述的C培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入0.6～0.8 mg NAA、7.5~8.5 mg 6‑BA、200~250 mg Cef和50~75 mg Kan；（4）将步骤（3）挑取的初步筛选植株芽移至D培养基中，经16h光照/8h黑暗条件下培养20～30天，挑取绿色植株芽，制得中度筛选植株芽；所述的D培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入2.0~3.0 mg GA3、2.0‑3.0 mg 6‑BA、200~250 mg Cef和90~100 mg Kan；（5）将步骤（4）制得的中度筛选植株芽移至E培养基中，经16h光照/8h黑暗条件下培养20～30天，挑取绿色植株芽，制得深度筛选植株芽；所述的E培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入2.0~3.0 mg GA3、2.0~3.0 mg 6‑BA、200~250 mg Cef和110~120 mg Kan；（6）将步骤（5）制得的深度筛选植株芽移至F培养基中，经16h光照/8h黑暗条件下培养20～30天，制得转化植株；所述的F培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入IBA 0.6~0.7 mg、NAA 0.1~0.2 mg、GA3 1.0~1.5 mg、肌醇 80~100 mg、VB1 1.0~1.2 mg，pH5.8；所述的液体MS基本培养基为在MS基本培养基的基础上去除琼脂成分获得。