[发明专利]一种水培液中微生物基因组DNA的提取方法

摘要

本发明涉及一种水培液中微生物基因组DNA的提取方法，属于生物技术领域。本发明的提取方法先将水培液中的杂质通过定性滤纸进行过滤去除，进一步0.22μm的滤膜收集水体微生物，用液氮/65℃水浴的冻融方法破碎微生物细胞，再加入SDS及溶菌酶裂解细胞，CTAB结合蛋白质及多聚糖、游离核酸，加入酚、氯仿混合物萃取后，萃取液用异丙醇沉淀，最终获得水体微生物基因组DNA。利用该方法提取的核酸纯度较高，且产量较高。试验证明，此法提取的水体微生物DNA，完整性好，纯度较高，进一步纯化后可用于下游的基因组文库构建、qPCR、高通量测序等。

主权项

一种水培液中微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤：(1)水体样品杂质的去除：取100~250ml的水培液用定性滤纸过滤3~5次，并收集滤液；进一步用孔径为0.22μm的滤膜进行超滤，通过滤膜收集水体中的菌体，剪碎滤膜并置于10ml的离心管中；(2)水体微生物细胞裂解：往步骤（1）10ml的离心管中加入500μl无菌水，漩涡震荡，然后在液氮2~3 min和65℃水浴5min中反复冻融3~5次，冻融结束后，于4℃ 13000rpm下离心 10min，弃上清，收集沉淀，加入100μl 1×TE，重悬沉淀，加入30μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃温浴1~3h，再加入500μl 的10% SDS，以及10ul 20mg/ml的蛋白酶K，37℃温浴1~2h；(3)核酸游离及沉淀：步骤（2）温浴结束后加入200μl 5M的NaCl，加入100μl 65℃预热的3×CTAB/NaCl，65℃温浴1h，待冷却后，加入等体积的酚、氯仿混合液，酚、氯仿的体积比为（1:1），4℃ 11000rpm 离心10min，取上清，再加入等体积的酚、氯仿混合液，酚、氯仿的体积比为（1:1），4℃ 11000rpm 离心10min，将上清移至新管并加入等体积预冷的异丙醇，‑20℃放置1h，然后4℃ 11000rpm 离心 20min，弃上清，沉淀用70%乙醇重悬并于4℃ 11000rpm 下离心 10min，弃上清，沉淀于超净工作台中吹干后溶于30~50ul的无菌水中，‑80℃保存。