[发明专利]一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除方法无效
| 申请号： | 201410295367.0 | 申请日： | 2014-06-26 |
| 公开（公告）号： | CN104046647A | 公开（公告）日： | 2014-09-17 |
| 发明（设计）人： | 尚广东;陈中秋;庄浩;李玲 | 申请（专利权）人： | 南京师范大学 |
| 主分类号： | C12N15/74 | 分类号： | C12N15/74;C12N1/20;C12R1/41 |
| 代理公司： | 南京知识律师事务所 32207 | 代理人： | 卢亚丽 |
| 地址： | 210046 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明涉及一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除方法。具体实施步骤为首先通过重叠－延伸聚合酶链式反应扩增获得两侧为针对待敲除基因的约500bp同源片段、中间为卡那霉素抗性基因的融合DNA片段。其次将此DNA片段电转化至异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组酶表达的Rm1021细胞中，在卡那霉素抗性筛选之下，卡那霉素抗性基因取代目的基因而获得基因敲除变株。最后将菌株在含0.4％蔗糖的固体培养基中培养以消除含重组酶基因的质粒。所使用的重组酶基因来源于λ噬菌体并克隆在质粒pLS2406之上，pLS2406同时含有负筛选标记sacB基因。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 重组 工程 苜蓿 中华 根瘤菌 rm1021 基因 方法 | ||
【主权项】：
一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除方法，其特征在于包括以下步骤：(1)通过重叠－延伸聚合酶链式反应扩增获得两侧为针对待敲除基因500bp同源片段、中间为卡那霉素抗性基因的融合DNA片段；(2)融合DNA片段电转化至由异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷诱导的、克隆在质粒pLS2406中的重组酶基因表达的Rm1021细胞中，在卡那霉素抗性筛选之下，卡那霉素抗性基因取代目的基因而获得基因敲除变株；(3)将基因敲除变株在含0.4％蔗糖的固体培养基中培养以消除含重组酶基因的质粒pL2S406。
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