[发明专利]一种提取土生隐球酵母线粒体的方法

摘要

本发明公开了一种提取土生隐球酵母线粒体的方法，本方法对现有差速离心法的操作步骤、提取缓冲液的组分和配制方法进行改良，延长菌体预处理时间，期间不断震荡；在酶解破壁步骤中，改良酶解缓冲液的组分，增加蜗牛酶的用量同时添加纤维素酶，延长酶解破壁的时间和孵育温度，使菌体破壁彻底，增加原生质体的得率；为了原生质体裂解温和不至于破坏线粒体，原生质体裂解液和线粒体洗涤缓冲液均用PBS配制。用该方法可以提取到高质量的线粒体，其结构完整，细胞色素氧化酶系统没有被破坏，具有活性。该方法提取到的线粒体可以用于以线粒体为研究对象的生理生化研究。该方法具有简单、经济、易于操作等优点，适合在普通生物实验室中操作和推广。

主权项

一种提取土生隐球酵母线粒体的方法，其特征在于按以下操作进行：（1）将GM或者YPD液体培养基中培养到对数生长期的土生隐球酵母离心收集菌体，用pH 7.5的0.05mol/L Tris缓冲液洗涤三遍，然后加入预处理缓冲液，在25‑30℃下，100‑200 rpm摇60‑120 min；（2）将上述溶液离心弃去上清，沉淀用0.01mol/L PBS洗两次，然后离心收集沉淀；（3）向沉淀中加入酶解缓冲液，混匀后在温度为28‑36 ℃，转速100‑200 rpm条件下处理2‑6 h，取样在显微镜下观察原生质体形成情况；（4）在显微镜下观察到大部分菌体都破壁形成了原生质体后，离心去掉酶解缓冲液，用0.01mol/L PBS洗一次，取沉淀，加入原生质体裂解液，混匀，然后加入5倍体积的玻璃珠涡旋振荡10‑30 min，取样在显微镜下观察原生质体破碎情况；（5）于4 ℃，1200‑1800 g离心10 min去沉淀，用原生质体裂解液重复洗涤2‑3次，每次均弃去沉淀收集上清液，将所得上清液在4 ℃，12000‑20000 g离心20 min收集沉淀；（6）加入线粒体洗涤缓冲液，在4 ℃，1200‑1800 g离心10 min去沉淀；（7）将上述上清液在4 ℃，12000‑20000 g离心20 min后收集沉淀，所得沉淀即为线粒体。