[发明专利]桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体及其构建方法和应用

摘要

本发明一种桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明利用载体PFGC5941为框架，通过双酶切，在其内含子两边分别插入桔小实蝇细胞色素P450基因的正反向特异性目的片段，构成RNA干扰载体非常重要的区域，构建的RNA干扰表达载体在转化到植株后，在其强启动子CaMV35S的驱动下，在其体细胞内转录形成双链RNA的“发卡结构”，使得桔小实蝇取食植株后体内同源基因片段的正常表达和翻译受到影响，实现干扰昆虫正常生长发育，达到植株抗桔小实蝇的目的，对桔小实蝇的控制发挥重要作用，减少化学农药使用量。

主权项

一种桔小实蝇细胞色素P450基因的RNA干扰载体的构建方法，其特征在于：以PFGC5941载体作为骨架载体，以桔小实蝇细胞色素P450基因部分片段为正或反义链，所述细胞色素P450基因部分片段序列如SEQ ID NO.1，所述正义链插入在酶切位点XhoI和NcoI之间，反义链插入在酶切位点XbalI和BamHI之间；具体包括如下步骤：1）细胞色素P450基因目的片段与质粒的连接提取桔小实蝇总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板，以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3为引物对细胞色素P450基因的正向目的片段进行PCR扩增，以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5为引物对细胞色素P450基因的反向目的片段进行PCR扩增，得到PCR产物，目的片段约为600bp，回收PCR产物，与载体pMD‑19连接，转化大肠杆菌DH5α得到重组质粒pMD‑19‑P1F1和pMD‑19‑P2F2，进行序列验证，测序正确的目的片段即可用于RNA干扰载体的构建；所述SEQ ID NO.2～5的序列如下：SEQ ID NO.2：5’‑GCCATGGATAGTCTGAACGAACCGAA‑3’；SEQ ID NO.3：5’‑CCATGGGATAGATTTCGGGATCAC‑3’；SEQ ID NO.4：5’‑GCTCTAGAGCATAGTCTGAACGAACCGAA‑3’；SEQ ID NO.5：5’‑CGGGATCCGATAGATTTCGGGATCAC‑3’；2）细胞色素P450基因的RNA干扰载体的构建将上述测序正确的细胞色素P450基因正向目的片段质粒pMD‑19‑P1F1与载体PFGC5941分别用XhoI和NcoI双酶切，将pMD‑19‑P1F1与载体PFGC5941的酶切产物进行连接得到插入正向目的片段的重组质粒PFGC5941‑P1F1；将PFGC5941‑P1F1和细胞色素P450基因反向目的片段质粒pMD‑19‑P2F2分别用XbalI和BamHI双酶切，将酶切产物进行连接，即可得到插入正、反义链的RNA干扰载体PFGC5941‑P1F1/P2F2，经PCR扩增检测、核苷酸序列分析，目的片段序列正确的干扰载体可用于农杆菌转化。