[发明专利]一种高效表达与制备外分泌型人源AFP的方法

摘要

一种高效表达与制备外分泌型人源AFP的方法，该方法主要包括如下三个方面的内容(1)利用基因合成技术合成AFP的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物学方法构建酵母重组表达质粒PpICZ α A‑AFP，并进行质粒抽提；(2)使用毕赤酵母表达系统体外诱导表达分泌型AFP重组蛋白，并通过优化表达时间、诱导剂添加量等条件得出最佳诱导条件；(3)优化硫酸铵分级沉淀,从发酵液上清中分离纯化得到分泌到胞外的AFP重组蛋白，在55％硫酸铵浓度下目的蛋白AFP几乎全部析出，且纯度高达98.844％；本发明将纯化得到的分泌重组蛋白AFP用临床检测电化学发光法检测其生物活性，其值达3500ng/mL。

主权项

一种高效表达与制备外分泌型人源AFP的方法，其特征在于该方法主要包括如下三个方面的内容：(1) 利用基因合成技术合成AFP的DNA序列，再采用基因克隆和分子生物学方法构建酵母重组表达质粒PpICZ α A‑AFP，并进行质粒抽提；(2) 使用毕赤酵母表达系统体外诱导表达分泌型AFP重组蛋白，并通过优化表达时间、诱导剂添加量条件得出最佳诱导条件；(3) 优化硫酸铵分级沉淀, 从发酵液上清中分离纯化得到分泌到胞外的AFP重组蛋白，在55％硫酸铵浓度下目的蛋白AFP几乎全部析出，且纯度高达98.844％；所述三个方面的内容中，分别包含有如下步骤：第(1)方面的内容中包括如下步骤：a. 利用基因合成技术，合成人源AFP序列；b. 设计带酶切位点的引物，通过PCR得到带有双酶切位点的AFP克隆质粒，并进行质粒提取；第(2)方面的内容中包括如下步骤：c.将b步骤中获得的质粒通过双酶切克隆到PpICZ α A载体中，构建PpICZ α A‑AFP重组表达质粒，并进行质粒抽提；d. 将c步骤中获得的质粒进行线性化后电转进入毕赤酵母GS115中，通过优化感受态细胞GS115浓度，获取高转染率，通过PCR鉴定挑取阳性克隆；e. 将d步骤中挑取的阳性克隆同时用甲醇进行小量诱导表达，通过对甲醇添加量、诱导时间、菌密度表达条件的优化，获得最佳诱导表达条件并获取最佳表达重组菌；f. 通过步骤e中实验得出，甲醇浓度为0.5％，诱导表达第3天的重组蛋白的分泌量最大；g. 通过前面实验的基础，再将表达体系扩大至2L，收集表达第3天的发酵上清液；第(3)方面的内容中包括如下两个步骤：h. 将g步骤中获得的发酵液通过硫酸铵分级沉淀纯化蛋白，设计不同硫酸铵浓度梯度获得沉淀蛋白；i. 将h步骤中获得的蛋白回溶后经透析，测其含量和纯度得出目的蛋白在55％硫酸铵浓度下几乎已全部析出，且经HPLC检测其纯度高达98.844％。