[发明专利]一种铬富集植物李氏禾RAPD反应体系的建立方法

摘要

本发明公开了一种铬富集植物李氏禾RAPD反应体系的建立方法，该方法通过用CTAB法提取李氏禾的总DNA，针对模板、引物、dNTP、Taq酶四个方面的用量进行探索，从而建立李氏禾的RAPD最适反应体系，所述李氏禾RAPD反应体系中模板DNA用量为0.5μL，包含0.5μLdNTP，对应于dNTP的浓度为200μmol/L；Taq酶的最适用量为2.0U。本发明为进行RAPD分析研究重金属铬污染下李氏禾居群的遗传多样性奠定基础，进而为进一步从分子水平上研究李氏禾耐淹耐干旱能力和重金属富集能力与其在遗传特性上的关系提供相关的分子生物学方面的研究数据。

主权项

一种铬富集植物李氏禾RAPD反应体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)李氏禾基因组总DNA的提取①取硅胶干燥后的李氏禾叶片50mg放入已灭菌1.8mL离心管，加入适量石英砂和玻璃珠，珠磨器研磨1min至叶片成均匀粉末；②加入65℃预热的0.8mL2×CTAB和20μL巯基乙醇，混合均匀，65℃水浴3小时，每间隔10分钟摇匀一下，然后10000rpm，离心10min；③量取上清，加入酚、氯仿和异戊醇，酚/氯仿/异戊醇的体积比为25:24:1，颠倒混匀，12000rpm，离心10min；④量取上清，加入氯仿和异戊醇，氯仿/异戊醇体积比为24:1，颠倒混匀，然后12000rpm离心10min；⑤小心量取上清，加入1/10体积的NaAc，轻轻翻转混匀；⑥加入的异丙醇，轻轻上下颠倒离心管8～10次，冰浴20min，使DNA沉淀充分；⑦10000rpm离心5～10min，弃去上清，用70％乙醇洗涤沉淀1次；⑧再用100％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管至管内完全干燥，加20μL无菌水溶解DNA；⑨取5μLDNA溶液进行电泳检测，其余于‑20℃放置保存；(2)李氏禾RAPD反应随机引物的初步筛选：确定使用引物S55作为李氏禾RAPD反应体系优化的引物；(3)所述李氏禾RAPD反应体系中模板DNA用量为0.5μL；(4)所述李氏禾RAPD反应体系中包含0.5μLdNTP，对应于dNTP的浓度为200μmol/L；(5)所述李氏禾RAPD反应体系中Taq酶的最适用量为2.0U。