[发明专利]植物基因组定点修饰方法

摘要

本发明提供了植物基因组定点修饰方法。具体地，本发明提供了一种RNA引导的植物基因组定点修饰方法。通过使用特定结构的核酸构建物，本发明方法可在预定的植物基因组位点，高效地进行定点修饰。本发明方法有助于高效地筛选具有改良性状的植物。

主权项

一种植物基因组定点修饰方法，其特征在于，包括步骤：(a)将一表达嵌合RNA和Cas蛋白的核酸构建物导入植物细胞，获得转化的植物细胞，其中所述嵌合RNA是由特异性识别待定点修饰的CRISPR RNA和反式作用型CRISPR RNA所构成的嵌合体；和(b)在合适的条件下，使转化的植物细胞中的所述核酸构建物转录形成嵌合RNA，并且使所述转化的植物细胞表达所述的Cas蛋白，从而使得在所述嵌合RNA的引导下，在所述转化的植物细胞中，通过所述Cas蛋白对基因组DNA进行定点切割，从而进行基因组定点修饰，其中所述核酸构建物包括第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物，其中第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物是相互独立的，或是一体的；其中，第一亚核酸构建物包括从5'至3'的以下元件：第一植物启动子；与所述第一植物启动子操作性相连的嵌合RNA的编码序列，所述嵌合RNA的编码序列的结构如式I所示：A‑B   (I)式中，A为编码CRISPR RNA的DNA序列；B为编码反式作用型CRISPR RNA的DNA序列；“‑”表示A和B之间的连接键或连接序列；其中，由所述嵌合RNA的编码序列转录形成一个完整的RNA分子，即嵌合RNA；和RNA转录终止子；第二亚核酸构建物包括5'至3'的以下元件:第二植物启动子；与所述第二植物启动子操作性相连的Cas蛋白的编码序列，并且所述Cas蛋白的是N端、C端或两侧与核定位序列融合的融合蛋白；和植物转录终止子；其中，所述的第一植物启动子选自下组：AtU6‑26、OsU6‑2或其组合，并且所述的第二植物启动子和与所述Cas蛋白的编码序列之间5'至3'还操作性相连有：第三亚核酸构建物，其中，所述的第三亚核酸构建物为来源于番茄矮壮病毒的p19蛋白编码序列；和自剪切序列，其中，所述的自剪切序列为2A多肽编码序列。