[发明专利]一种酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法

摘要

本发明是一种酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白，也是一种低抗原性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：选取主要含有Ⅰ型胶原蛋白的鱼鳞作为原料，经碱处理去除杂蛋白和脂肪，酸处理去除鱼鳞的钙盐后，添加弱酸溶液作为提取剂，同时加入胃蛋白酶进行低温搅拌浸提，浸提后冷冻离心得酶溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液；然后将酶溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液通过膜分离技术纯化，再用冷冻干燥，即得纯度不低于90％，保持三螺旋结构的酶溶性Ⅰ型胶原蛋白。运用本发明方法所制备的胶原蛋白产品抗原性低，构型明确，三螺旋结构完整，通过HPLC检测，为纯度≥90％的Ⅰ型胶原蛋白，通过MALDI-TOF-MS检测，质谱图无杂峰，其分子量为288kDa。

主权项

一种酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，其步骤如下：(1)原料预处理将鱼鳞投入反应釜中，加入鱼鳞重量2～10倍的碱溶液，搅拌1～12小时，除掉鱼鳞包括脂肪和杂蛋白在内的杂质，用水洗净，加入鱼鳞重量2～10倍的酸溶液，搅拌1～12小时，再用水洗净，其中碱溶液的质量体积浓度为1～4％，酸溶液的质量体积浓度为3～8％，预处理温度控制在0～25℃之间；(2)Ⅰ型胶原蛋白提取向处理后的原料中添加0.05～10mol/L的弱酸作为提取剂，浸提温度为0～10℃，原料与提取剂的重量比为1:10，同时加入原料重量0.05％～5％的胃蛋白酶进行2～72小时的搅拌浸提，提取步骤重复0～5次，浸提液混合汇总，再进行冷冻离心过滤，所得的离心上清液为酶溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液，(3)Ⅰ型胶原蛋白分离纯化膜分离工艺技术纯化酶溶性I型胶原蛋白粗提液，粗提液用孔径为0.2～0.1μm或相对分子量为300KD～200KD的超滤膜，超滤膜流速为0.91～1.82立方米/小时，膜压力为0.1～0.4Mpa，温度为0～10℃，去除残余的胃蛋白酶、小分子杂质和无机盐，浓缩得到色谱纯度≥90％，具备三螺旋结构的高纯I型胶原蛋白溶液；(4)Ⅰ型胶原蛋白冷冻干燥冷冻干燥热敏性的I型胶原蛋白溶液，得到酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白成品。