[发明专利]一种酶法生产α-酮戊二酸的方法

摘要

一种酶法生产α-酮戊二酸的方法，分别合成glr基因和daao基因，构建表达载体pET24a-glr的构建和表达载体pET24a-daao；表达载体pET24a-glr和表达载体pET24a-daao分别双酶切后连接，构建双表达载体pET24a-glr-daao转入大肠杆菌，制备同时表达谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌；在发酵罐中加入该工程菌的湿菌体至水中，然后加入L-谷氨酸、过氧化氢酶，最后用氢氧化钠调pH，制备出反应体系进行反应；将反应结束的反后应体系中转化出的α-酮戊二酸进行分离纯化；本发明成本低，转化率和产物浓度高，转化率达到84%以上，更适合工业应用。

主权项

一种酶法生产α‑酮戊二酸的方法，其特征在于：其生产方法包括以下步骤：步骤一、同时表达谷氨酸消旋酶和D‑氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建 (1)、表达载体pET24a‑glr的构建a、根据全球公共数据库GenBank，登录号AB003685.1所述记载来自于枯草芽孢杆菌IFO 3336编码谷氨酸消旋酶的glr基因序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI，起始密码子由TTG改为ATG后，进行全基因合成，合成的glr基因具体序列如SEQ ID NO：1；b、将合成的glr基因用NdeI和BamHI双酶切，纯化备用；c、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的glr基因片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；d、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得glr表达载体pET24a‑glr；(2)、表达载体pET24a‑daao的构建a、根据全球公共数据库GenBank，登录号AB003685.1所述记载来自于变异三角酵母CBS4095菌株中编码D‑氨基酸氧化酶的基因daao序列，两端分别加上酶切位点NdeI和BamHI后，进行全基因合成，合成的daao基因具体序列如SEQ ID NO：2；b、将合成的daao基因用NdeI和BamHI双酶切，纯化备用；c、抽提大肠杆菌表达载体pET24a，用NdeI和BamHI双酶切，与上步纯化的daao片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；d、挑取阳性转化子并测序鉴定后，抽提质粒获得daao表达载体pET24a‑daao； (3)、同时表达谷氨酸消旋酶和D‑氨基酸氧化酶的基因工程菌的构建a、将构建好的表达载体pET24a‑ daao，用BglII和HindIII双酶切，回收包含了T7启动子、核糖体结合位点和daao基因编码序列的片段，纯化备用；b、构建好的表达载体pET24a‑glr，用BamHI和HindIII双酶切，纯化，利用BglII和BamHI同尾酶的特性与上述a中所准备好的基因片段连接，得到连接后基因片段，备用；c、将上述连接后基因片段转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子并测序鉴定；抽提质粒获得glr和daao双表达载体pET24a‑glr‑daao；d、将双表达载体pET24a‑glr‑daao转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中，获得可以诱导同时表达谷氨酸消旋酶和D‑氨基酸氧化酶的基因工程菌；步骤二、基因工程菌的培养将上述步骤一所制备的同时表达谷氨酸消旋酶和D‑氨基酸氧化酶的基因工程菌进行培养，培养的过程中加入异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷，最后收集菌体，得到同时表达谷氨酸消旋酶和D‑氨基酸氧化酶的基因工程菌，备用；步骤三、以L‑谷氨酸为原料，转化生产α‑酮戊二酸在发酵罐中加入同时表达谷氨酸消旋酶和D‑氨基酸氧化酶的基因工程菌湿菌体至水中，湿菌体的质量为水质量的3‑5%，然后加入L‑谷氨酸至终浓度90‑100g/L，再加入过氧化氢酶至浓度为100万‑400万单位/升，最后用氢氧化钠调pH至7.5‑8.2，即制备出反应体系；水浴保持反应体系在30‑40℃，通气搅拌反应，即将反应体系中的L‑谷氨酸转化为α‑酮戊二酸；检测反应体系中α‑酮戊二酸的含量；步骤四、α‑酮戊二酸的分离纯化将反应体系中转化出的α‑酮戊二酸进行分离纯化即生产出α‑酮戊二酸。