[发明专利]一种牡丹酚的层析分离纯化方法

摘要

本发明是有关于一种牡丹酚的层析分离纯化方法。该方法包括如下步骤：细胞破碎、盐析、透析、选择柱层析、装柱、上样走柱以及洗脱干燥。本发明的技术方案减少了传统蒸馏法中因溶解于热蒸汽而消失的部分牡丹酚，同时达到了对于牡丹酚分离过程中温度的控制，有效减少了牡丹酚这种有机物在高温中的分解，从而达到用最少的牡丹丹皮消耗，分离纯化出最多具有镇痛、抗炎、解热、抑制变态反应；对疼痛具有明显的镇痛作；对炎症反应具有明显的抑制作用；对体温升高具有明显的解热作用；对II、III、IV型变态反应均具有抑制作用；牡丹酚能够抑制细胞内氧自由基的产生，能够使皮肤增白的效果。

主权项

一种牡丹酚的层析分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤：(a)细胞破碎：把冷冻保存的牡丹丹皮在破碎前一天取出，在室温下解冻→称取牡丹丹皮提取物悬液，记录体积和质量→加入等体积PBS→样品装在烧杯中，使用超声细胞粉碎机进行细胞破碎；在冰浴下用玻棒沿烧杯壁轻轻搅动，使破碎更完全，破碎后的样品记为样品1；(b)盐析：将上述步骤(a)取得的样品1→冷冻离心，除去沉淀→加入固体(NH₄)₂SO₄，使其达到饱和→静置→冷冻离心，除去沉淀→在上清液中加入(NH₄)₂SO₄，使其达到饱和→静置→冷冻离心，除去上清液，所得样品记为样品2，其中固体(NH₄)₂SO₄用量是参考硫酸铵沉淀试剂表，(NH₄)₂SO₄用前先碾匀，加(NH₄)₂SO₄的过程要缓慢，并一边轻轻搅拌，加完(NH₄)₂SO₄后继续搅拌几分钟；(c)透析：收集上述步骤(b)盐析后所得的沉淀，装入透析袋，排除气泡，用透析夹封住袋口，将装有样品的透析袋置于合适容器中加入PBS缓冲液，开始透析，当透析数小时，所得的样品记为粗提液；(d)选择柱层析：在牡丹丹皮提取物牡丹酚分离纯化过程中，不同的层析柱在洗脱条件方面不尽相同，在柱型及洗脱条件的选择上参考各种填料的性质并进行改进；(e)装柱：选取合适规格层析柱→竖直固定柱子→调整流出管高度→往预加水/缓冲液的柱子中，小心装入处理好的填料→平衡，装柱过程应避免气泡产生，用蓝色葡聚糖2000过柱，检验装柱效果；(f)上样走柱：在上样前，用搅拌器小幅度搅动，使柱顶端部分填料重悬→静置→待液面与柱面相隔高度h时，沿层析柱内壁旋转加入样液，注意不要破坏柱面；(g)洗脱干燥：样品完全进入柱体后，加入洗脱缓冲液，调整好各相关仪器，开始洗脱，洗脱结束干燥后获得牡丹酚成品。