[发明专利]一种曲马多人工抗原的制备方法

摘要

本发明提供了一种曲马多人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测：以曲马多与5-溴戊酸乙酯为原料通过化学修饰，接臂，反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛丙种球蛋白(BGG)结合制备曲马多的人工抗原即曲马多-牛丙种球蛋白。所制备的曲马多人工抗原可进行动物免疫，取得相应的曲马多抗体，可用于各种曲马多类免疫分析法的研究，为曲马多的检测提供更加方便快速准确的途径。

主权项

一种曲马多人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1) 制备人工半抗原：(a) 将盐酸曲马多溶于纯化水，滴加25% 氢氧化钠，游离使之pH≈10；加入5‑溴戊酸乙酯330ul，在80~90℃的油浴中反应3小时；展开剂：95%乙醇：氨水：二氯甲烷：1，4‑二氧六环=8: 1: 10: 1（v/v），Rf=0.6‑0.7；(b) 反应结束后，用1N盐酸调pH=5.5，减压蒸干，得油状产物Ⅰ；(c) 产物Ⅰ用薄层色谱分析（TLC）法分离，展开剂：95%乙醇：氨水：二氯甲烷：1，4‑二氧六环=8: 1: 10: 1（v/v），Rf=0.6‑0.7；收集所需部分硅胶，用无水乙醇提取，减压蒸干，得无色油状产物Ⅱ；(d) 产物Ⅱ按比例加入纯化水后，用DAS调pH=9，减压蒸干；按比例加入N,N‑二甲基甲酰胺，过滤，滤液蒸干，得曲马多半抗原；反应比例：产物Ⅱ：纯化水：N,N‑二甲基甲酰胺： =100mg：10ml：10ml；    (2) 制备曲马多人工抗原：(e) 将曲马多半抗原溶于N,N‑二甲基甲酰胺中，加入N‑羟基琥珀酰亚胺、环己基碳酰二亚胺，反应比例：曲马多半抗原：N,N‑二甲基甲酰胺：N‑羟基琥珀酰亚胺：环己基碳酰二亚胺=20mg：1ml：10mg：17mg，室温搅拌反应18小时以上，反应结束后离心取上清液记为A液；(f) 将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2~7.4；(g) 将BGG蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；(h) 将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5，得到的混合液在2‑8℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；(i)将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：曲马多‑牛丙种球蛋白。