[发明专利]一种CYP2D6基因多位点突变检测方法

摘要

本发明公开了一种CYP2D6基因多位点突变检测方法。本发明所述检测方法是基于Taqman的等位基因差异分析法，提供CYP2D6基因的单碱基置换、缺失突变、基因缺失和重复突变4种类型的8个功能性单体型变异的检测。使用本发明所述CYP2D6基因多位点突变检测方法，可以覆盖CYP2D6基因的98％功能性位点，且全部操作过程仅需4h，人工操作时间少于2h，省时省力。本发明所述检测方法的检测灵敏度高，样品阳性符合率及阴性符合率均99％以上，适合推广应用。

主权项

一种CYP2D6基因多位点突变检测方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：(1)提取CYP2D6基因组DNA作为模板；(2)设计特异性引物和探针：CYP2D6*2的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示；相应的探针分别为5’端VIC标记野生型探针和5’端FAM标记突变型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示；CYP2D6*3的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示；相应的探针分别为5’端VIC标记野生型探针和5’端FAM标记缺失型探针，核苷酸系列如SEQ ID NO:7～8所示；CYP2D6*4的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9～10所示；相应的探针分别为5’端VIC标记野生型探针和5’端FAM标记突变型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:11～12所示；CYP2D6*5在基因缺失时的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示；相应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:15；CYP2D6在基因重复时的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13～14所示；相应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；参比基因ALB的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:16～17所示；相应的探针核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；CYP2D6*9的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:19～20所示；相应的探针分别为5’端HEX标记野生型探针和5’端FAM标记缺失型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:21～22所示；CYP2D6*10的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:23～24所示；相应的探针分别为5’端FAM标记野生型探针和5’端HEX标记缺失型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:25～26所示；CYP2D6*14的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:27～28所示；相应的探针分别为5’端FAM标记野生型探针和5’端HEX标记缺失型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:29～30所示；CYP2D6*41的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:31～32所示；相应的探针分别为5’端FAM标记野生型探针和5’端HEX标记缺失型探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:33～34所示；(3)荧光定量PCR反应：所述荧光定量PCR反应的反应体系为：浓度为100ng/25μL、体积为1～5μL的步骤(1)所述模板；浓度为0.5μM、体积为1.25μL的步骤(2)所述引物；浓度为0.25μM、体积为0.625μL的步骤(2)所述探针；12.5μL的2×qPCR Master Mix；补加ddH₂O至反应体系的总体积为25μL；所述荧光定量PCR反应的反应程序为：(i)95℃，10min；(ii)95℃，10s；(iii)58℃，45s；(iv)37℃，10s；其中，(ii)和(iii)进行40个循环；(4)检测结果判定。